Техника Flow-Enhanced Ultrasound позволяет нам изображать сосудистую систему глаза в трех измерениях, без использования контрастных веществ. Основным преимуществом этого метода является его стабильность для изображения облицовки, позади пигментированной сетчатки, что является сложной задачей с несколькими методами оптической визуализации. Мы демонстрируем этот метод на золотых рыбках, но он может быть применен ко всем видам с ядерными эритроцитами, что позволяет исследователям получить представление о функциональной эволюции глаз.
Этот метод может быть применен исследователями с базовой подготовкой в ультразвуковой визуализации и обращении с животными. После подтверждения оптимального уровня анестезии расположите животное в позе, позволяющей прямой доступ сверху, к глазу. Поместите подходящую ультразвуковую среду на глаз животного.
Если чешуйчатые веки закрывают глаза, то аккуратно сместите их ватным тампоном. Для водных животных вода хорошо работает в качестве ультразвуковой среды, далее, позиционируйте ультразвуковой преобразователь, медиальный к глазу, в дорсальной вентральной или ростральной каудальной ориентации, в зависимости от желаемой ориентации изображения. В B-режиме, с максимальной глубиной резкости, изобразите медиальную и самую глубокую часть глаза, чтобы убедиться, что все интересующие структуры видны в поле изображения.
Медленно переводите преобразователь в каждую сторону, проверяя изображения в реальном времени. Убедитесь, что все интересующие структуры видны в поле изображения. Если нет, переключитесь на преобразователь с более низкой частотой и большей глубиной резкости.
Отрегулируйте глубину изображения, смещение глубины, ширину изображения и количество положений фокусных зон, чтобы охватить нужную область интереса во всех трех пространственных измерениях. Затем установите частоту кадров в диапазоне от 50 до 120 кадров в секунду. Затем отрегулируйте коэффициент усиления 2D до уровня, чтобы анатомические структуры были видны только в B-режиме, чтобы увеличить отношение сигнал/шум при последующей реконструкции с усилением потока.
Чтобы получить 2D-изображение с улучшенным потоком в положении одного среза, переведите преобразователь в это положение и перейдите к реконструкции изображения с улучшенным потоком. Чтобы получить 3D-запись целого интересующего региона, переведите преобразователь в одну крайность интересующей области. Чтобы определить точное положение крайнего конца, увеличьте 2D-усиление, ненадолго.
После того, как датчик установлен правильно, уменьшите коэффициент усиления 2D перед записью, чтобы обеспечить максимальное соотношение сигнал/шум при последующей реконструкции с усилением потока. Для каждого шага или фрагмента в 3D-записи получите более 100 кадров. Затем, используя микроманипулятор или встроенный двигатель преобразователя, переведите преобразователь по всей интересующей области с шагом 25 или 50 микрометров и повторите получение более 100 кадров для каждого шага.
Для построения изображений с улучшенным потоком экспортируйте записи в формат файла DICOM. Чтобы создать одно изображение с улучшенным потоком на основе записи сцены более чем на 100 кадров, рассчитайте стандартное отклонение на уровне пикселей с помощью этой формулы и повторите вычисление для каждого фрагмента в 3D-записи. Чтобы автоматизировать расчет стандартного отклонения и процесс реконструкции изображения для нескольких срезов в 3D-записи, проведите эту операцию в пакетном режиме с помощью ImageJ и макроскрипта, представленного в текстовой рукописи.
Объедините все реконструированные изображения в один стек изображений с помощью команды Images to Stack в ImageJ. Затем с помощью команды «Свойства» задает толщину фрагмента от размера шага, используемого при получении, и сохраняет стек изображений в виде 3D-файла TIFF. Наличие ядерных эритроцитов у взрослых позвоночных млекопитающих, не подвергающихся рекламе, обеспечивает положительный контраст текущей крови по сравнению со статической тканью в сценических записях.
Однако, когда теперь анализируется кадр за кадром, четкое различие между кровью и окружающими тканями менее очевидно. Эта процедура усиления кровотока, по сути, компилирует запись нескольких временных точек в 2D-пространстве в единое изображение, где в присущем сигналу колебание значения в пикселях, расположенных в текущей крови, набирает более высокое стандартное отклонение, чем окружающая статическая ткань, производя положительный контраст. В 3D-съемках несколько параллельных срезов с известным интервалом могут быть объединены в данные 3D-изображения.
Его можно использовать для трехмерного объемного рендеринга и анатомического моделирования. Ультразвуковая визуализация на основе допплера также предоставляет возможность специально изображать кровоток, однако, с меньшей чувствительностью, чем этот метод. Эта ультразвуковая процедура с усиленным потоком позволяет проводить визуализацию кровотока у ряда видов с ядерными эритроцитами.
Глубокие глазные сосудистые русла, такие как сосудисто-сосудистая оболочка rete mirabile у некоторых рыб, могут быть изображены, если присутствуют у вида. Метод ограничен отсутствием ядерных эритроцитов у млекопитающих, у которых процедура усиления потока производит некоторую степень контраста кровотока, но не так отчетливо, как у видов с ядерными эритроцитами. Ультразвук, усиленный потоком, чувствителен к шуму движения.
Дыхательные движения могут вызвать размытие изображения и артефакты, такие как улучшение границы ткани. Проспективный или ретроспективный гатинг может быть использован для настройки шума движения. Как для 2D, так и для 3D-приобретений крайне важно ограничить артефакты движения, вызванные движением животного, из-за недостаточной анестезии на нестабильном датчике.
Развитие данной методики, проложило путь для неинвазивного исследования in vivo глубоких сосудистых сетей в глазу подавляющего большинства позвоночных, обладающих нуклеированными эритроцитами.
