Die Flow-Enhanced Ultrasound-Technik ermöglicht es uns, das Gefäßsystem des Auges in drei Dimensionen abzubilden, ohne den Einsatz von Kontrastmitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Stabilität, um das Vester hinter der pigmentierten Netzhaut abzubilden, was bei mehreren optischen Bildgebungstechniken eine Herausforderung darstellt. Wir demonstrieren diese Technik bei Goldfischen, aber sie kann auf alle Arten mit kernhaltigen roten Blutkörperchen angewendet werden, so dass die Forscher einen Einblick in die funktionelle Evolution der Augen gewinnen können.
Diese Technik kann von Forschern mit einer Grundausbildung in Ultraschallbildgebung und Tierhandhabung angewendet werden. Nachdem Sie ein optimales Anästhesieniveau bestätigt haben, positionieren Sie das Tier in einer Haltung, die einen direkten Zugang von oben zum Auge ermöglicht. Legen Sie ein geeignetes Ultraschallmedium auf das Auge des Tieres.
Wenn geschuppte Augenlider das Auge bedecken, verschieben Sie diese vorsichtig mit einem Wattestäbchen. Bei Wassertieren eignet sich Wasser gut als Ultraschallmedium, Als nächstes positionieren Sie den Ultraschallwandler, medial für das Auge, entweder in einer dorsalen ventralen oder rostralen kaudalen Ausrichtung, abhängig von der gewünschten Bildausrichtung. Im B-Modus mit maximaler Schärfentiefe können Sie den medialen und tiefsten Teil des Auges abbilden, um sicherzustellen, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind.
Übersetzen Sie den Wandler langsam auf jede Seite, während Sie die Echtzeitbilder inspizieren. Stellen Sie sicher, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind. Wenn nicht, wechseln Sie zu einem Wandler mit einer niedrigeren Frequenz und einer größeren Schärfentiefe.
Passen Sie die Bildtiefe, den Tiefenversatz, die Bildbreite und die Anzahl der Positionen der Fokuszonen an, um den gewünschten Interessenbereich in allen drei Raumdimensionen abzudecken. Stellen Sie dann die Bildrate im Bereich von 50 bis 120 Bildern pro Sekunde ein. Als nächstes passen Sie die 2D-Verstärkung auf ein Niveau an, so dass die anatomischen Strukturen in der B-Mode-Aufnahme nur gerade noch sichtbar sind, um das Signal-Rausch-Verhältnis in der anschließenden strömungsverstärkten Rekonstruktion zu erhöhen.
Um ein 2D-Flow-verstärktes Bild an einer einzelnen Slice-Position zu erfassen, übersetzen Sie den Wandler in diese Position und fahren Sie mit der flussverstärkten Bildrekonstruktion fort. Um eine 3D-Aufnahme einer ganzen Region von Interesse zu erhalten, übersetzen Sie den Wandler in ein Extrem der Region von Interesse. Um die genaue Position des extremen Endes zu bestimmen, erhöhen Sie die 2D-Verstärkung kurz.
Nachdem der Wandler richtig platziert wurde, verringern Sie die 2D-Verstärkung vor der Aufnahme, um ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis bei der anschließenden flussverstärkten Rekonstruktion zu gewährleisten. Erfassen Sie für jeden Schritt oder jede Slice in der 3D-Aufnahme mehr als 100 Bilder. Übersetzen Sie dann mit einem Mikromanipulator oder einem eingebauten Wandlermotor den Wandler über die gesamte Region von Interesse, in Schritten von entweder 25 oder 50 Mikrometern, und wiederholen Sie die Erfassung von mehr als 100 Bildern für jeden Schritt.
Für eine flussoptimierte Bildkonstruktion exportieren Sie die Aufnahmen in das DICOM-Dateiformat. Um ein einzelnes flussverbessertes Bild basierend auf einer Szenenaufnahme mit mehr als 100 Bildern zu erzeugen, berechnen Sie die Standardabweichung auf Pixelebene mit dieser Formel und wiederholen Sie die Berechnung für jedes Segment in der 3D-Aufnahme. Um die Standardabweichungsberechnung und den Bildrekonstruktionsprozess für mehrere Segmente in einer 3D-Aufzeichnung zu automatisieren, führen Sie diesen Vorgang im Batch-Modus mit ImageJ und dem Makroskript durch, das im Textmanuskript bereitgestellt wird.
Kombinieren Sie alle rekonstruierten Bilder in einem Bildstapel mit dem Befehl "Zu stapelnde Bilder" in ImageJ. Geben Sie dann mit dem Befehl Eigenschaften die Segmentdicke aus der während der Aufnahme verwendeten Schrittgröße an und speichern Sie den Bildstapel als 3D-TIFF-Datei. Das Vorhandensein von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei nicht-erwachsenen Säugetierwirbeltieren bietet einen positiven Kontrast des fließenden Blutes im Vergleich zu statischem Gewebe in Szenenaufnahmen.
Wenn man nun jedoch Bild für Bild analysiert, ist die klare Unterscheidung zwischen Blut und umgebendem Gewebe weniger offensichtlich. Dieses Verfahren zur Verbesserung des Blutflusses stellt im Wesentlichen eine Mehrzeitpunktaufnahme im 2D-Raum in einem einzigen Bild zusammen, wobei im inhärenten Signalwert die Fluktuation in Pixeln, die im fließenden Blut positioniert sind, eine höhere Standardabweichung als das umgebende statische Gewebe aufweist und einen positiven Kontrast erzeugt. Bei 3D-Aufnahmen können mehrere parallele Slices mit bekanntem Abstand zu 3D-Bilddaten kombiniert werden.
Es kann für dreidimensionales Volumen-Rendering und anatomische Modellierung verwendet werden. Die Doppler-basierte Ultraschallbildgebung bietet auch die Möglichkeit, den Blutfluss spezifisch abzubilden, jedoch mit geringerer Empfindlichkeit als diese Methode. Dieses flussverstärkte Ultraschallverfahren ermöglicht die Bildgebung des Blutflusses bei einer Reihe von Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen.
Tiefe Augengefäßbetten, wie die Aderhaut rete mirabile bei einigen Fischen, können abgebildet werden, wenn sie in der Art vorhanden sind. Die Methode ist durch das Fehlen von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei Säugetieren begrenzt, bei denen das Flussverbesserungsverfahren einen gewissen Blutflusskontrast erzeugt, aber nicht so ausgeprägt ist wie bei Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen. Flow-verstärkter Ultraschall reagiert empfindlich auf Bewegungsgeräusche.
Atembewegungen können zu Bildunschärfen und Artefakten wie der Verbesserung der Geweberänder führen. Prospektives oder retrospektives Gating kann verwendet werden, um Bewegungsgeräusche anzupassen. Sowohl für 2D- als auch für 3D-Aufnahmen ist es wichtig, Bewegungsartefakte zu begrenzen, die durch die Bewegung des Tieres verursacht werden, da eine unzureichende Anästhesie auf einem instabilen Wandler eingerichtet ist.
Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Weg für die nicht-invasive In-vivo-Untersuchung tiefer Gefäßnetzwerke im Auge der überwiegenden Mehrheit der Wirbeltiere, die kernhaltige Erythrozyten besitzen.
