Flow-Enhanced Ultrasound技术使我们能够在不使用造影剂的情况下以三维方式对眼睛的脉管系统进行成像。这种技术的主要优点是它对色素沉着的视网膜后面的外脏进行成像的稳定性，这在几种光学成像技术中具有挑战性。我们在金鱼中展示了这种技术，但它可以应用于所有具有有核红细胞的物种，使研究人员能够深入了解眼睛的功能进化。
该技术可以由具有超声成像和动物处理基本培训的研究人员应用。确认最佳麻醉水平后，将动物置于允许从上方直接进入眼睛的姿势。将合适的超声介质放在动物的眼睛上。
如果鳞片眼睑覆盖眼睛，则用棉签轻轻移位。对于水生动物，水作为超声介质效果很好，接下来，根据所需的图像方向，将超声换能器（内侧）定位在背侧腹侧或喙尾方向。在B模式下，以最大景深对眼睛的内侧和最深处进行成像，以确保所有感兴趣的结构在图像场中都可见。
慢慢地将换能器平移到每一侧，同时检查实时图像。确保所有感兴趣的结构在图像字段中都可见。如果没有，请切换到频率较低、景深较大的换能器。
调整图像深度、深度偏移、图像宽度和焦点区域的位置数，以覆盖所有三个空间维度中所需的感兴趣区域。然后，将帧速率设置为每秒 50 到 120 帧。接下来，将2D增益调整到一个水平，使得解剖结构在B模式采集中仅可见，以增加后续流量增强重建中的信噪比。
要在单个切片位置获取2D流动增强图像，请将换能器平移到该位置，然后继续进行流动增强图像重建。要获取整个感兴趣区域的 3D 记录，请将换能器转换为感兴趣区域的一个极端。要确定极端端的确切位置，请简要增加2D增益。
正确放置传感器后，在录制前降低2D增益，以确保在随后的流量增强重建中具有最大的信噪比。对于 3D 录制中的每个步骤或切片，采集大于 100 帧的帧。然后，使用微型机械手或内置传感器电机，以25或50微米的步长将传感器平移到整个感兴趣区域，并为每个步骤重复采集超过100帧。
对于流程增强的影像构建，请将录制文件导出为 DICOM 文件格式。要基于大于 100 帧的场景记录生成单个流动增强图像，请使用此公式计算像素级别的标准偏差，并对 3D 记录中的每个切片重复计算。要自动执行 3D 记录中多个切片的标准偏差计算和图像重建过程，请使用文本手稿中提供的 ImageJ 和宏脚本在批处理模式下执行此操作。
使用 ImageJ 中的“图像到堆栈”命令将所有重建的图像合并到一个图像堆栈中。然后，使用“属性”命令，根据采集期间使用的步长指定切片厚度，并将图像堆栈另存为 3D TIFF 文件。与场景记录中的静态组织相比，非成年哺乳动物脊椎动物中存在有核红细胞，为流动的血液提供了积极的对比。
然而，现在逐帧分析时，血液和周围组织之间的明显区别就不那么明显了。这种血流增强程序，本质上，将2D空间中的多时间点记录编译成单个图像，其中在固有的信号值波动的像素中，定位在流动的血液中，得分比周围的静态组织更高的标准偏差，产生正对比度。在 3D 采集中，可以将具有已知间距的多个平行切片组合成 3D 图像数据。
它可用于三维体积渲染和解剖建模。基于多普勒的超声成像也提供了特异性成像血流的选择，但是，灵敏度低于该方法。这种流量增强的超声程序允许对一系列具有有核红细胞的物种进行血流成像。
如果存在于该物种中，则可以对深部眼血管床（例如某些鱼类中的脉络膜爬行动物奇幻床）进行成像。该方法受到哺乳动物中没有有核红细胞的限制，其中流量增强程序产生一定程度的血流对比度，但不像具有有核红细胞的物种那样明显。流量增强型超声对运动噪声敏感。
呼吸运动可导致图像模糊和伪影，例如组织边界增强。前瞻性或回顾性门控可用于调整运动噪声。对于2D和3D采集，由于不稳定的换能器设置的麻醉不足，限制由动物移动引起的运动伪影至关重要。
该技术的发展为绝大多数脊椎动物眼中深层血管网络的非侵入性体内检查铺平了道路，这些脊椎动物拥有有核红细胞。
