Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción. Y la endocrinología. Y son aplicables al estudio del síndrome de ovario poliquístico o SOP e hiperandrogenismo.
La ventaja de esta técnica es que facilita una liberación constante, uniforme y a largo plazo de las hormonas de una manera rentable y efectiva. JHUs que tratará el procedimiento será Ping Xue, un técnico de mi laboratorio. Para la preparación de dihidrotestosterona o pellets DHT, utilice una cuchilla de afeitar para cortar una pieza de 15 milímetros de tubo de silicona.
Y utilice una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 20 contundente para inyectar silicona adhesiva médica de dos a cinco milímetros en un extremo del tubo. Deje que el tubo se seque durante la noche. Y compruebe si hay burbujas de aire en el extremo sellado.
El uso del equipo de protección personal adecuado verter polvo DHT en un bote de plástico en la fluidez. Impresione el extremo abierto del tubo tapado adhesivo en el polvo. Usando un clip de papel grande enderezado, aplace el polvo hacia abajo en el tubo, hasta que el DHT alcance la profundidad experimental adecuada.
A continuación, selle el lado abierto del tubo con silicona durante la noche. A la mañana siguiente, corte cada lado sellado para obtener una longitud de dos milímetros de silicona en ambos lados del DHT y sin pellets de control DHT. A continuación, almacene los pellets en el tubo cónico de 50 mililitros envuelto con papel de aluminio a temperatura ambiente durante un máximo de tres meses.
Para la generación de modelos de ratón SOP equilibrar hasta 20 DHT o controlar pellets en tubos cónicos separados de 50 mililitros que contienen 30 mililitros de 0.9 por ciento de solución salina durante 24 horas a 37 grados Celsius. Al día siguiente, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón hembra anestesado de dos meses de edad y use gasa estéril para administrar povidona-yodo secuencial y 70 por ciento exfoliantes de etynol a la zona quirúrgica. A continuación, haga una incisión de cinco milímetros a través de la piel cerca del cuello.
Y usa un trocar de diez calibres para hacer un túnel de 15 milímetros en la dirección rostral. Utilice el trocar para insertar un pellet dorsalmente en el túnel y sellar la incisión con el adhesivo quirúrgico. Aproximar manualmente los bordes de la herida con fórceps y utilizar suaves pinceladas para aplicar tres finas capas de película de adhesivo líquido a un centímetro de cada lado de los bordes opuestos de la herida.
A continuación, coloque el ratón solo en una jaula sobre una almohadilla de calor con monitoreo hasta la recumbencia completa. Sustitución del pellet cada cuatro semanas para mantener un nivel constante de exposición a andrógenos. Tres días después de la inserción del pellet, utilice una pipeta p10 para chorros diez microlitros de solución salina estéril en la cavidad vaginal y utilice la punta de la pipeta para recuperar inmediatamente la solución salina.
Extienda la muestra de solución salina de la célula vaginal en un portaobjetos etiquetado. Y deje que la solución salina se seque a temperatura ambiente. Fijar los portaobjetos secos en un recipiente de 100 por ciento de etynol durante al menos cinco minutos.
A continuación, manche las diapositivas durante un minuto cada una en el búfer B y el tampón C de un kit de tinción dif-quick. Al final de la inveneción C lave los toboganes con agua del grifo durante tres segundos y séquelos a temperatura ambiente. Para determinar la cíclica estrosa ver las diapositivas bajo el objetivo de diez veces de un microscopio de luz.
Cuente los días en cada etapa y divida por el número total de días para calcular el porcentaje de tiempo en cada etapa. Para probar la tolerancia a la glucosa, 20 días de inserción de DHT, ayuna los ratones durante la noche. Pesar los ratones a la mañana siguiente, y utilizar un glucómetro y tiras de prueba para medir el nivel de glucosa de albahaca de la sangre de la vena de la cola.
Inyectar a los ratones con dos gramos por kilogramo de peso corporal de 20 por ciento dextrosa. A continuación, mida el nivel de glucosa de las muestras de sangre de la vena de cola a 15, 30, 60, 90, 120 minutos después de la administración de dextrosa. Para adquirir la descendencia femenina de las damas insertadas DHT, mueva el ratón hembra a probado en la jaula con un macho fértil probado en el día 15, después de la inserción del pellet.
Documente el peso corporal de las damas cada semana para determinar si el ratón está embarazada. En el día siete después del parto, sumerge una punta de lanceta en pasta de tatuaje y marca cada cachorro con un tatuaje en la punta. Pesar los ratones marcados cada siete días hasta los 70 días de edad.
Entre la fecha postnatal 12 a 16, pon un puñetazo en los ratones para numerarlos según el sistema como se ilustra en la figura. Para distinguir el sexo, examine el lado ventral de cada ratón etiquetado. Las hembras tendrán pezones visibles.
Para recoger muestras de sangre para varios análisis aguas abajo, utilice una lanceta para recoger el volumen experimental aproximado de sangre entre las nueve y diez de la mañana mediante sangrado de vena submandibular. Y centrifugar las muestras para permitir la recolección de suero. A continuación, almacene las muestras de suero en tubos de micro centrífuga de 1,5 mililitros a menos 80 grados centígrados hasta su análisis.
Para evaluar la pubertad en la descendencia femenina DHT, todos los días después del destete en el día 21 después del parto, compruebe la abertura vaginal mediante inspección visual. Y usa calibres para medir la distancia anó genital. Aunque los valores absolutos de DHT sérico son diferentes entre la espectrometría de masas y el análisis de Elisa, el cambio popular relativo de la inserción de DHT frente a la inserción sin DHT es similar tanto de los ensayos como de los experimentos.
Los niveles de DHT se incrementan significativamente desde la preconcepción hasta el embarazo en DHT y no ratones DHT. Sin embargo, los niveles de DHT son dos veces más altos en ratones DHT en comparación con ningún ratone DHT en puntos de tiempo preconcepcionales y gestacionales. Las hijas adultas de DHT exhiben diferencias en la función reproductiva.
Por ejemplo, la cíclica eestrosa interrumpida en comparación con las hijas adultas sin DHT que experimentan tiempos significativamente más largos en metestrus diestrus y menos tiempo en pro-esterous y esterous. Al intentar este procedimiento es importante recordar incubar los pellets durante 24 horas antes de que se utilizan para la liberación uniforme de la hormona. Después de este procedimiento, también se pueden examinar las consecuencias reproductivas y metabólicas de la exposición a DHT.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la endrocronología y las interacciones fetales maternas estudiaran el SOP y el impacto del hiperandrogenismo de bajo nivel en ratones hembra. No olvide que trabajar con DHT puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como usar guantes y una máscara y gafas, y trabajar en una capucha de bioseabilidad, siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.
