Este protocolo ayuda a analizar cuantitativamente la estructura 3D de las uniones neuromusculares a una resolución cercana a la microscopía electrónica mediante un procedimiento simple. La principal ventaja de este protocolo es que las muestras musculares se procesan de manera similar y se inmunomarcan para microscopía confocal y STED, lo que reduce el tiempo para la evaluación precisa de la estructura de la unión neuromuscular en modelos animales. La cuantificación morfológica que desarrollamos se puede adaptar fácilmente para analizar otras estructuras subcelulares.
Martina Marinello, una científica de mi equipo que mostrará cómo se realizan las burlas musculares y las inmunotinciones y dará algunas recomendaciones para la aplicación exitosa de este protocolo. Me complace presentar al Dr. Jeremie Cosette de la plataforma de imágenes de Genethon, quien mostrará la adquisición y el análisis de imágenes utilizando microscopios confocales y STED. Después de la eutanasia, comience a burlarse de los músculos tibiales anteriores en pequeños haces de fibras de aproximadamente un milímetro de ancho usando dos pinzas dentadas finas.
Luego, transfiera estos haces musculares a una placa de 24 pocillos que contenga 1% de Triton X-100 preparado en PBS y deje que se agite suavemente durante una hora a temperatura ambiente o cinco horas a cuatro grados centígrados. Después de lavar las muestras tres veces durante cinco minutos con PBS a temperatura ambiente, incubar las muestras con una solución de bloqueo compuesta de 4% BSA preparada en PBS con 1% Triton X-100 durante cuatro horas a cuatro grados centígrados bajo agitación suave. Luego, incubar las muestras durante la noche con la misma solución bloqueante que contiene anticuerpos monoclonales primarios contra el neurofilamento M o la glicoproteína 2 de la vesícula sináptica para marcar terminales axónicos presinápticos o zonas activas, respectivamente.
Al día siguiente, lave los haces musculares etiquetados tres veces durante cinco minutos con PBS bajo agitación suave. Luego, incubarlos con anticuerpos secundarios apropiados colocándolos en un agitador durante dos horas a temperatura ambiente. Después de lavar los haces musculares nuevamente, colóquelos en un portaobjetos con medio de montaje.
Luego, coloque un deslizamiento de cubierta de vidrio de 1.5 grados en la parte superior, seguido de imanes cilíndricos a ambos lados de la diapositiva para aplicar presión y aplanar los músculos. Para adquirir imágenes utilizando el microscopio confocal, inicie el software del microscopio y elija la máquina como modo de configuración y recopile pilas de imágenes de las uniones neuromusculares en cada grupo experimental según los ajustes mencionados en el manuscrito de texto. Al final de la sesión, haga clic en Abrir en el visor 3D y elija una unión neuromuscular representativa de un grupo experimental para visualizar el etiquetado 3D.
Para calcular la unión neuromuscular postsináptica y el volumen de la placa, el área de proyección de intensidad máxima y la tortuosidad relativa, arrastre y suelte la macro para la cuantificación del volumen de la unión neuromuscular en la ventana Imagen J y, cuando la macro se abra en una segunda ventana, haga clic en Macros y Ejecutar macro. Seleccione la carpeta nativa que contiene las subcarpetas de unión a analizar y haga clic en Seleccionar. Luego, en el menú emergente de guardar carpeta, seleccione la carpeta de almacenamiento y haga clic en Seleccionar.
En el nuevo menú emergente denominado Tipo de imagen, seleccione el formato de las adquisiciones de la pila Z. Seleccione el canal RGB correspondiente a la tinción de interés e indique X, tamaño de píxel Y y paso Z. Si se seleccionan formatos de archivo propietarios, la macro lee directamente el tamaño del píxel y el paso Z.
Para cuantificar la acumulación de neurofilamentos presinápticos, arrastre y suelte la macro para la cuantificación de la acumulación de la unión neuromuscular a la ventana Imagen J y haga clic en Macros y Ejecutar macro. Seleccione las subcarpetas de unión, la carpeta de almacenamiento y el formato de las adquisiciones de la pila Z como se demostró anteriormente. Luego, en la ventana emergente Información de tinción, indique la etiqueta y el color presinápticos y postsinápticos y haga clic en OK.In la ventana emergente Tamaño de píxel, indique el tamaño de píxel X, Y como 0.072 micrómetros, el paso Z como 0.5 micrómetros y haga clic en Aceptar. Si se seleccionan formatos de archivo propietarios, la macro lee directamente el tamaño del píxel y el paso Z.
Para calcular la distancia entre las franjas del receptor de acetilcolina, seleccione el menú Cuantificar en la parte superior de la ventana central. Haga clic en la pestaña Herramientas, seleccione intensidad y haga clic en el icono de perfil de línea. Establezca Sobremuestreo en uno y marque Ordenar canales.
Haga clic en la pestaña Abrir proyectos y seleccione la imagen filtrada a analizar. A continuación, haga clic en el icono de línea de dibujo y trace una línea que cruce perpendicularmente varias franjas o pliegues de unión. Haga clic en la parte superior del primer pico y mueva el puntero del ratón mientras pulsa el botón izquierdo del ratón hasta que se alcance el siguiente pico máximo.
Tenga en cuenta el valor DX, que corresponde a la distancia entre los dos picos. Haga clic derecho en el ratón mientras está en la imagen de la ventana derecha y seleccione Guardar ROIs. Después de hacer clic en el icono de flecha, haga clic en el ROI y elimínelo haciendo clic en el icono de la papelera.
Para calcular el ancho de la banda del receptor de acetilcolina, seleccione la intensidad en el panel superior izquierdo debajo de la pestaña herramientas, haga clic en el icono determinar FWHM y marque los canales de clasificación. Luego haga clic en la pestaña Abrir proyectos y seleccione la imagen filtrada a analizar. A continuación, haga clic en el icono de dibujar rectángulo en el menú superior de la ventana derecha.
Seleccione una franja horizontal o vertical y dibuje un rectángulo perpendicularmente a la banda. Aparece un perfil en la ventana central. Haga clic en vertical u horizontal del menú Proyección promedio ubicado en el panel izquierdo, dependiendo de si la orientación de la franja es vertical u horizontal.
Haga clic en Estadísticas en la ventana central para leer el valor FWHM y luego guarde y elimine los ROI como se demostró anteriormente. La placa terminal motora postsináptica, marcada con alfa-bungarotoxina fluorescente, apareció más pequeña y fragmentada en los mutantes de dos líneas de ratón. La cuantificación de las pilas Z de la unión neuromuscular utilizando las macros personalizadas de la Imagen J reveló una marcada disminución en el volumen de la placa terminal, la proyección de intensidad máxima y la tortuosidad relativa en ambos modelos de ratón de enfermedad en comparación con los controles, lo que indica defectos de maduración de la unión neuromuscular.
La cuantificación de la distribución de la rama terminal del axón presináptico utilizando la macro personalizada Image J reveló un patrón alterado en la distribución de neurofilamentos M en los dos modelos animales con mayor inmunomarcaje. A través de la tinción de glicoproteína 2 de vesícula sináptica, se observó una reducción del 43% en la relación de ocupación de las regiones que contienen receptores de acetilcolina con zonas activas terminales nerviosas adyacentes en ratones Smn 2B / ratones. El aspecto de las placas terminales postsinápticas de la unión neuromuscular se visualizó claramente mediante el marcado fluorescente de alfa-bungarotoxina y el análisis del perfil de intensidad.
La evaluación de los parámetros de la unión neuromuscular reveló un aumento en la distancia del pliegue de unión y el ancho de las rayas del receptor de acetilcolina en el músculo gastrocnemio de los mutantes. Para obtener resultados confiables, es crucial burlarse de los músculos correctamente, prestando especial atención a la fuerza aplicada para separar los haces musculares. Este protocolo puede ayudar a obtener una caracterización morfológica más profunda de la unión neuromuscular, que anteriormente se explicaba solo por procedimientos complejos y lentos, como la microscopía electrónica de transmisión.
El procedimiento de imagen STED allanó el camino para la investigación de nuevos conocimientos sobre los marcadores pre y postsinápticos, que contribuyen a la fisiopatología de las enfermedades que afectan la unión neuromuscular.
