Nos gustaría dar las gracias a Manuela Budak, Marinkovi Ljiljana y Wullimann Kristina por su excelente asistencia técnica. Damos las gracias a W. Macklin para proporcionar GFP-Plp ratones. TM es apoyado por el Instituto de Estudios Avanzados (Technische Universität München), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB Sonderforschungsbereich 596), por la Alexander-von-Humboldt-Foundation y por la administración nacional (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) en el marco de ERA-NET NEURON &quot;iPSoALS&quot; y &quot;2-fotón de imagen&quot;. TM y MB son apoyados por el Centro para la Ciencia Proteína Integrado (Munich). PM fue apoyado por la Escuela de Postgrado de la Universidad Técnica de Munich (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1) Tiempo: 15 min. <ol><li> Preparar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de pinzas, 1 par de tijeras, 1 par de tijeras de primavera, un plato de cultivo de tejidos (10-cm). Pre-burbujeó (mínimo de 15 min) refrigerado (4 ° C) solución de Ringer con 5% de CO 2/95% O 2. Llena de 15 cm placa de cultivo de tejidos con hielo y se cubre con una placa de metal. Preparar microscopio de disección y colocar el plato 15-cm con hielo bajo el alcance de disección con el fin de enfriar el explante durante la disección. </li><li> Letalmente anestesiar el ratón por sobredosis isoflurano (o cualquier otro método aprobado de sacrificio). Pulverizar el ratón con 70% de etanol para evitar la contaminación de la piel explante. Por SC blanqueo, hemos utilizado Plp-GFP ratones, que se pueden cruzar para Thy1-OFP3 o Thy1 Membow13-para la visualización simultánea del axón. </li><li> Uso del par de tijeras de gran tamaño, hacer una incisión de línea media dela piel sobre el esternón y dos incisiones paralelas al borde inferior de la caja torácica. </li><li> Uso del par de tijeras de gran tamaño, retire la piel, abrir la pared abdominal, y hacer incisiones paralelas a la caja torácica todo el camino de vuelta a la columna vertebral. Después de disecar los músculos pectorales haciendo incisiones cerca de la inserción del músculo en el esternón. </li><li> Cortar el diafragma abierto justo debajo del cartílago xifoides y diseccionar fuera de la membrana a lo largo de sus inserciones costales. </li><li> Sosteniendo la caja torácica por el proceso xifoides con un conjunto de pinzas, comience a cortar las costillas de la columna vertebral, lo más cerca posible de sus inserciones. Los recortes izquierdo y derecho deben converger por encima del corazón hacia el manubrio del esternón. Trate de no cortar los principales vasos sanguíneos (especialmente las venas subclavias). Mejor visibilidad se logra levantando suavemente la preparación mientras se apoya en el apéndice xifoides con fórceps. </li><li> Haga un corte transversal justo por debajo del manubrio del esternóny transferir el explante en el plato 10-cm con CO 2 al 5% enfriado / 95% O 2-burbujeó la solución de Ringer. Colocar el plato 10-cm en la placa de metal que cubre el plato de tejido 15-cm cultura lleno de hielo. Todos los pasos se deben hacer bajo el microscopio de disección. </li><li> Con unas tijeras pequeñas primavera eliminar los restos de timo, la pleura, el diafragma (el interior) y los músculos pectorales (externos; Figura 1B-D). </li><li> Para colocar el explante al plato de 3,5 cm, la disección de todas las costillas que no se insertan en el esternón. Esto se hace mejor usando unas tijeras pequeñas resorte y cortar el tejido entre las costillas (Figura 1E). </li><li> Pin el esternón triangularis músculo y el nervio explante en el Sylgard recubierto de 3,5 cm de placa de cultivo de tejidos utilizando pins minutien (abreviado a &lt;4 mm; Figura 1G). Dos pasadores deben pasar por cartilaginosos (blanco) partes del esternón. Insertar al menos dos pasadores a través de los nervios, tanto en el lado izquierdo y derecho de thexplante e apuntando a las partes más blandas cartilaginosos y evitando las costillas por debajo o cerca del músculo triangularis. Los pasadores se utilizan más, mejor (usamos normalmente 8-10). A medida que precisar la preparación, asegúrese de que las costillas son algo extendido, se fija el músculo en una posición ligeramente estirado. </li><li> Opcional: visualizar los sitios sinápticos que contienen receptores de acetilcolina mediante la adición de bungarotoxina acoplados a colorantes Alexa (concentración de 0,8 g / ml en 5% de CO 2 / O 95% de 2-burbujeó la solución de Ringer). Incubar explante clavada en el plato recubierto Sylgard durante 15-20 min a temperatura ambiente y luego se lava varias veces con 5% de CO 2/95% O 2-burbujear la solución de Ringer. </li></ol> 2. SC blanquear y opcional Time-lapse microscopía (Figura 2) Tiempo: 30 - 45 min + opcional 1 - 5 horas por lapso de tiempo. <ol><li> Transferencia de 3,5 cm Sylgard recubierto plato a un ingenio microscopio confocal equipadoh un láser de argón (488 nm de longitud de onda) y los objetivos de inmersión en agua (4x, 0,13 NA, 20x, 100x y NA 0,5, 1,0 NA o 60x, 0,9 NA). </li><li> Opcional para microscopía de lapso de tiempo: Insertar 3,5-cm Sylgard recubierto plato en anillo calefacción, instalar sistema de superfusión y sonda de temperatura (Figura 2A). Asegúrese de que ninguno de ellos toque el explante, el borde del plato o el recubrimiento Sylgard. Calentar la muestra a 33-35 ° C. Por SC blanqueo sin lapso de tiempo, la temperatura ambiente es mejor, ya que las células muestran menos dinámica entre las etapas de blanqueo. </li><li> Con el objetivo de 4x aire observar el patrón de inervación del músculo triangularis esternón y encontrar banda triangularis placa terminal esternón. Cambiar a 20x de inmersión de cono objetivo y empezar a buscar regiones superficiales dentro de la banda placa terminal (costillas áreas superpuestas son buenos candidatos). Cambio de objetivo 60x a 100x o inmersión de cono objetivo de comprobar en NMJs individuales. Ideal es un NMJ que está cubierta por SCS varios y se encuentra muy superficially (Figura 2B). Si se realiza una vez-lapse de imágenes después del blanqueo, seleccione hasta 3 NMJs que están relativamente cerca entre sí para aumentar el rendimiento. </li><li> Adquirir una imagen confocal de la UNM antes de foto-blanqueamiento SCs individuales (Figura 2B). (Para obtener imágenes de resolución completa, por ejemplo en un microscopio Olympus FV1000, utilizar un 100x, 1,0 NA objetivo zoom y 2,5, lo que resulta en Nyquist-limitado muestreo de ~ 0,1 m por píxel.) </li><li> &quot;Park&quot; el haz de láser 488 nm de forma centralizada en el núcleo de un SC utilizando la máxima potencia durante 5 segundos (alternativamente un patrón de exploración eficaz en una pequeña región de interés puede ser utilizado, tal como el &quot;tornado scan&quot; función en un microscopio Olympus; como se utiliza un microscopio confocal, el láser se centró en los planos conjugados de imagen y, por tanto, a 488 nm con un objetivo de 1,0 NA, &lt;0,5 m de diámetro). Vuelva a centrarse en la célula y juez blanqueo resultado. Si es necesario, repita el paso blanqueo de nuevo hasta que los niveles de GFP son reducird hasta niveles cercanos a fondo. Adquirir una imagen después de la decoloración (Figura 2C). Es importante asegurarse de que la región blanqueada está fuera de cualquier superposición entre dos células - Si hay una superposición, el blanqueado en una segunda celda será obvio. </li><li> Repetir el paso anterior hasta que todos menos uno SC se blanquean (Figura 2D-E). El último &quot;blanquear&quot; SC es adecuado para confocal time-lapse microscopía. Reconstruir las células individuales por sustracción de imágenes, por ejemplo, utilizando software Photoshop, para delinear sola morfología SC y territorio (Figura 2F). Tenga en cuenta que restar dos magos añade ruido (por ejemplo, mediante la importación de ellos consecutivos en &quot;capas&quot; en Photoshop, y luego poner el canal superior a la &quot;diferencia&quot; en el menú desplegable en la parte superior de la pestaña de canales). Esto puede ser evitado mediante la opción &quot;Limpiar&quot; la función de los canales antes de la resta y recortar a la basura cualquier fondo que, obviamente, no se origina en lacélula blanqueada. Para optimizar el contraste, puede ser necesario ajustar el brillo de los dos canales en el &quot;nivel&quot; de la ventana. La imagen resultante de la célula blanqueada es el superpuesta a la imagen original de una sinapsis, pseudo-coloreado en un color único y transparente para colorear el territorio de la célula blanqueada en la imagen original (de hacer esto para todos blanqueada y el último , las células sin blanquear la imagen mostrada en la Figura resultados 2F). </li><li> Opcional: Inicio confocal time-lapse microscopía después del blanqueamiento todos menos un SC. Tome una imagen a intervalos fijos (por ejemplo cada 5 min a 10). Uso como potencia de láser poco como sea posible. Hasta 3 NMJs pueden ser reflejados en la misma sesión. </li><li> Hacer un mapa de los NMJs tiempo transcurrido tomando una imagen a 100x sin zoom, a continuación, imágenes de la región con los objetivos de 20x y 4x (Figura 2G-I). Este &quot;mapa&quot; es necesaria para encontrar NMJs siguientes inmunohistoquímica de un músculo determinado. </li><li> Para la imagenprocesamiento, convertir imágenes individuales en las proyecciones de máxima intensidad y guardar en formato tiff. Combine todos los z-proyectados puntos temporales en una pila y alinear en xy, por ejemplo, a través del &quot;stackreg&quot; plugin 10 en Fiji (un paquete basado en el código abierto de software ImageJ, National Institutes of Health). </li></ol> 3. La fijación y la inmunohistoquímica (Figura 3) Tiempo: Noche. <ol><li> Transferir el explante en un tubo de reacción de 50-ml que contiene al menos 15 ml de 4% de PFA retirando cuidadosamente los pins. Enviar a fijar la pared torácica anterior que contiene el músculo triangularis esternón durante 1 hora en hielo. Enjuague tejido fijado con glicina 0,1 M en PBS (para apagar fijador residual y por lo tanto reducir el fondo) durante al menos 10 min. Las muestras se pueden almacenar en este punto y procesados ​​posteriormente. </li><li> Transferir explante fija a una placa de 10-cm Sylgard cultivo de tejidos recubierto lleno con 0,01 M PBS. Cortar una forma trapezoidal con un siparalelo de hasta el esternón y el otro a través de las transiciones hueso-cartílago - contiene el músculo triangularis en su superficie. Retire las costillas inferiores con una horizontal (es decir, trans-esternal) cortado de modo que el extremo caudal del músculo triangularis puede ser visitado libremente (Figura 3A-D). </li><li> Insertar una aguja hipodérmica como un pasador en la parte superior del trapezoide (Figura 3E). El uso de una aguja hipodérmica unida a una jeringa de 1 ml y fórceps para extraer el músculo triangularis en la superficie suavemente sosteniendo en una esquina caudal del músculo y utilizando la aguja como un micro-bisturí. Asegúrese de que los cortes se realizan en paralelo al plano de la pared torácica. Una vez que la parte caudal del músculo se libera, insertar otra aguja hipodérmica como un pasador debajo del músculo a través de la pared torácica - esto inmoviliza la preparación y permite ejercer una tracción suave sobre el músculo usando fórceps (Figura 3F). A medida que se corte TISS conectivoinserciones ue, &quot;piel&quot; de distancia del músculo del tórax. Cortar apego caudal pasado con tijeras de primavera. Retire los restos de grasa y los vasos de sangre utilizando fórceps. Tenga cuidado de no rasgar lejos de los nervios Nota:. Utilice conjuntos separados de las herramientas y los platos para trabajar con tejido vivo y fijos. </li><li> Iniciar la inmunohistoquímica (usando un protocolo estándar) mediante la transferencia de muestras de tejido en solución de bloqueo durante 1 hora en un agitador a temperatura ambiente. Volumen más pequeño posible para la tinción es de 200 l usando una placa de 96 pocillos. </li><li> Aplicar el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo, 200 l por pocillo, durante la noche a 4 ° C en un agitador. </li><li> Lavar en 0,01 M PBS tres veces durante 10 min. </li><li> Aplicar el anticuerpo secundario adecuado para 1-2 horas a temperatura ambiente se diluyó en solución de bloqueo. </li><li> Lavar en 0,01 M PBS tres veces durante 10 min. </li><li> Montar en anti-fading medio (por ejemplo Vectashield) y cubreobjetos. </li><li> Colocar el portaobjetos en la placa de metal magnético, imán lugar en la parte superiorde la muestra para aplanar durante unas pocas horas o durante la noche a 4 ° C. Selle con esmalte de uñas. </li></ol>

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de blanqueo SC presentado aquí es sencillo, rápido y versátil: (i) Se permite revelar única morfología SC y dinámica por microscopía confocal basado en un único transgén - lo cual es una ventaja significativa cuando se combina con el enfoque por ejemplo, modelos de enfermedades que requieren alelos adicionales . (Ii) El método es rápido, a partir de la disección para la fijación se puede realizar en un medio día. (Iii) El número de aplicaciones es muy amplio, ya que puede ser combinado...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Company (ejemplo) </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Etanol 70% (vol / vol) de solución </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> en botella de spray </td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> cualquier otro anestésico aprobado puede ser utilizado para la anestesia letal </td></tr><tr><td> ratones transgénicos (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> para obtener de fuentes citadas </td></tr><tr><td> disección con microscopio de luz fría iluminación </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> equipado con Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> fórceps #2 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> fórceps # 5 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> tijeras, grandes médicos </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> tijeras, primavera ángulo pequeño </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> en línea calentador </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> calentar el anillo para los platos de 3,5 cm </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> dos temperaturas canal de control del sistema </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> sistema de bomba de superfusión </td><td></td><td></td><td> hecha a la medida </td></tr><tr><td> 15-cm placa de cultivo de tejidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> lleno de hielo y cubierta por placa de metal </td></tr><tr><td> 10-cm placa de cultivo de tejido </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> con solución de Ringer oxigenada de </td></tr><tr><td> 3,5 cm de placa de cultivo de tejido </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> lleno de Sylgard polímero </td></tr><tr><td> Sylgard polímero </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Elastómero de silicona Kit </td><td></td></tr><tr><td> microscopio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td><td> con láser de argón </td></tr><tr><td> 50-ml tubo de reacción </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PFA al 4% en PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> cánula de 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> jeringa de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> sinaptofisina anticuerpo </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> conejo </td></tr><tr><td> anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M de glicina en PBS </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> cubreobjetos </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositivas </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratorios </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien pins × 10 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-20 </td><td> acortado a &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxina acoplada a Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% suero normal de cabra </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Campanero burbujeaba con 95% O 2/5% CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Secuencial foto-blanqueador proporciona una manera no invasiva para etiquetar SCs individuales en la unión neuromuscular. El NMJ es el mayor sinapsis del sistema nervioso de los mamíferos y ha servido como guía modelo para estudiar la estructura y la función sináptica. En ratón terminales NMJs motor axón formar pretzel-como sitios de contacto con las fibras musculares. El axón motor y su terminal están rodeados por SCS. En las últimas décadas, varias ratones transgénicos se han generado para visualizar las neuronas motoras y SC, por ejemplo Thy1-XFP 1 y Plp-GFP ratones 2, respectivamente. A lo largo de los axones motores, mielinizantes CSs axonales están dispuestas en que no se solapan entrenudos, separadas por nódulos de Ranvier, para habilitar la propagación saltatoria potencial de acción. En contraste, los CSs de terminales en la sinapsis son células gliales, que supervisar y promover la neurotransmisión, digerir los desechos y los axones de regeneración de guía. NMJs están bien tapado, hasta la mitad de una docena no myelginarios CSs terminales - estos, sin embargo, no puede ser resuelto individualmente por microscopía de luz, ya que están en contacto directo membrana 3. Existen varios enfoques para visualizar individualmente CSs terminales. Ninguno de estos es impecable, sin embargo. Por ejemplo, el relleno de tinte, donde las células individuales están empalado con un microelectrodo de tinte lleno, necesita destruir una célula marcada antes de llenar un segundo. Esto no es compatible con las posteriores grabaciones con lapso de tiempo 3. Multiespectral &quot;Brainbow&quot; etiquetado de los CSs se ha logrado mediante el uso de la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes 4. Sin embargo, esta técnica requiere la combinación de varios transgenes y está limitada por el patrón de expresión de los promotores usados. En el futuro, la expresión de &quot;foto-conmutables&quot; proteínas en SC podría ser otra alternativa 5. Aquí presentamos secuencial foto-blanqueador, en donde las células individuales son blanqueados, y su imagen obtenida por sustracción. Creemosque este enfoque - debido a su facilidad y versatilidad - representa una adición duradera a la tecnología de la paleta neurocientífico, especialmente en lo que puede ser utilizado in vivo y se transfiere a otros tipos celulares, sitios anatómicos o especies 6. En el siguiente protocolo, que detalle la aplicación secuencial de blanqueo y posterior confocal de lapso de tiempo microscopía a las SC terminales en explantes de músculo triangularis esternón. Esta delgada, superficial y se diseca fácilmente nervio-músculo preparación 7,8 ha demostrado ser útil para el estudio de NMJ desarrollo, la fisiología y la patología 9. Por último, se explica cómo el músculo triangularis esternón se prepara después de la fijación de realizar una correlación alta resolución de imagen confocal, inmunohistoquímica o exámenes ultraestructurales.

Un ejemplo de un explante triangularis esternón plato listo para formación de imágenes se muestra en la Figura 1G. Este explante es particularmente adecuado para formación de imágenes NMJs ex vivo como el músculo triangularis consiste sólo en unas pocas capas de fibras musculares. Esto permite la obtención de imágenes de alta resolución a partir de explantes derivados de líneas de ratones transgénicos que seleccione ya sea SCS (Plp-GFP 2) y / o axones (Thy1-X...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. &quot;Sequential foto-blanqueamiento&quot; permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo y<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K vistas.  Technische Universität München. Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. "Sequential foto-blanqueamiento" permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiemp...

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Investigación

Neurociencias

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Disección e inmunohistoquímica de la pierna adulta de Drosophila para detectar cambios en la unión neuromuscular de una neurona motora identificada

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Visualización de las características morfológicas de la unión neuromuscular en el músculo gastrocnemio medial de rata

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...