Caracterizar la expresión génica a nivel transcriptómico es clave para comprender la función celular en la salud y la enfermedad. Nuestro método se centra en la captura de células endoteliales, la capa crucial de la pared vascular, de las arterias menestéricas de donantes humanos para el perfil transcriptómico con una resolución unicelular y espacial. Hay una población enriquecida de células endoteliales de un vaso sin un paso de clasificación, lo que puede causar pérdida celular.
Además, existen otros tipos de células que permiten la investigación de las interacciones célula-célula en el contexto tisular. Hemos utilizado esta técnica para investigar los cambios arteriales en la diabetes y la obesidad. Dependiendo de la disponibilidad del vaso, estas técnicas también se pueden reutilizar para explorar la biología en otras vasculaturas y otras enfermedades.
Si es la primera vez, dos pasos clave requieren la mayor cantidad de práctica. Uno, el raspado, aunque se debe ejercer la fuerza adecuada para eliminar las células integrales sin separar las capas más profundas. Y dos, la seccionamiento de criostatos.
Asegúrese de que las secciones sean frías, planas y estén dentro de los límites de la diapositiva especializada. Demostrando el procedimiento estarán Yingjun Luo y Xiaofang Tang, dos investigadores postdoctorales de mi laboratorio. Para comenzar, lave el tejido con DPBS.
Con pinzas estériles y tijeras de disección, retire la grasa y los tejidos conectivos externos hasta que el vaso esté limpio. Mide la longitud del recipiente con una regla colocada fuera del plato y toma registros fotográficos. Corte la arteria mesentérica longitudinalmente con tijeras para abrir la luz del vaso verticalmente.
Usando agujas, conecte el recipiente a la cera negra en las cuatro esquinas, exponiendo la íntima. Agregue un mililitro de tampón de digestión precalentado a la íntima. Usando un bisturí estéril, raspe suavemente la luz del vaso dos veces.
Transfiera el tampón de digestión a un tubo. Agregue un mililitro de tampón de digestión a la íntima y binote hacia arriba y hacia abajo con cuidado para recolectar las células restantes y transferir la suspensión celular a un tubo. Incubar células a 37 grados centígrados durante cinco minutos en una incubadora o en un balancín.
Agregue el medio M199 a la suspensión celular para apagar la reacción enzimática y mezclar suavemente. Centrifugar la suspensión durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y 600 veces G.At el final de la centrifugación, retirar y almacenar el sobrenadante por separado como cultivo de control para observar si todas las células se capturan en el pellet. Luego, vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de medio M199.
Evaluar la viabilidad celular mezclando 10 microlitros de azul tripano con 10 microlitros de material celular. Observe la morfología celular y cuente las células usando un hemocitómetro. Cubra dos pozos de una placa de seis pocillos pipeteando 500 microlitros de reactivo de fijación en pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de lavar los pozos con DPBS estériles, dispense el stock de células completas en un pozo, y el sobrenadante se mantiene como control en el segundo pozo. Centrifugar previamente el stock de células preparadas a cuatro grados Celsius y 600 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet suavemente con una pipeta P-1000 en 0.04% BSA en DPBS.
Mezcle bien para asegurar una suspensión de una sola celda. Pase la solución a través de un colador de 40 micrómetros para eliminar los desechos celulares. Luego, centrifuga la suspensión y retira el sobrenadante como se ha demostrado.
Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de 0.04% BSA en DPBS usando una pipeta P-1000 y mezcle bien para asegurar una suspensión de una sola celda. Como se demostró anteriormente, evalúe la viabilidad celular utilizando azul de tripano. Usando un hemocitómetro o un contador celular automatizado, observe la morfología de la suspensión de una sola célula, verifique si hay restos de tejido y calcule el número de células vivas y muertas.
Después de agregar isopentano a un recipiente de metal, enfríe en nitrógeno líquido o hielo seco. Vierta el compuesto OCT en pocillos de criomol de plástico etiquetado, evitando la formación de burbujas. Deje que el criomol de moho sobre hielo seco se enfríe.
Cortar al menos dos secciones coronales de un centímetro de longitud del buque. Usando pinzas de 12 pulgadas, sumerja el tejido en isopentano hasta que se congele. Sumerja rápidamente el tejido en OCT en orientación con el lumen visible en el centro.
Agarre y coloque los moldes criogénicos sobre hielo seco y observe la congelación. La OCT se volverá blanca progresivamente desde el exterior en uno o dos minutos. Guarde estas secciones en un recipiente seguro a menos 80 grados centígrados durante un máximo de seis meses.
Configure la temperatura criostato deseada para la cámara y la cabeza de la muestra. Equilibre las secciones de recipientes, cuchillos, cepillos y correderas incrustados en OCT a menos 20 grados Celsius en el criostato durante aproximadamente 30 minutos. Mientras equilibra, limpie la máquina y todo el equipo que pueda tocar las secciones, incluida la cuchilla, con etanol al 70% seguido de una solución de descontaminación RNasa.
Coloque la muestra dispensando una pequeña cantidad de OCT en el bloque de criostato circular y colocando la muestra encima antes de que se congele. Después de colocar el bloque en el centro de la cabeza de la muestra, atornille el bloque en su lugar con el mango negro alto a la izquierda. Elimine cualquier exceso de OCT que rodee el recipiente.
Ajuste el espesor de corte a 10 micrómetros en el criostato, corte aproximadamente 60 secciones y colóquelas en un tubo preenfriado de 1,5 mililitros que contenga reactivo de extracción de ARN. Vórtice hasta que las secciones se disuelvan por completo. Extraiga el ARN como se describe en el manuscrito de texto y disuelva el gránulo de ARN purificado en cinco microlitros de agua libre de RNasa.
Corte secciones de 10 micrómetros de espesor con la placa estabilizadora en su lugar. Voltee y aplane con cuidado tocando suavemente la sección a través de la OCT circundante. Limpie la diapositiva con etanol y caliente previamente la parte posterior del área de captura con el dedo.
Usando pinceles de criostato sin RNasa o la diapositiva directamente, coloque la sección de tejido dentro del cuadrado utilizando solo la OCT circundante. Coloque inmediatamente un dedo en la parte posterior del área de captura para derretir la sección a la diapositiva. Una vez que la sección se adhiera, coloque la diapositiva en la barra criogénica para permitir que la sección se congele.
Corte secciones de tejido de 10 micrómetros de espesor como se demostró anteriormente en diapositivas de optimización de tejidos o de expresión génica. Transfiera la diapositiva a un correo de diapositivas colocado sobre hielo seco. La figura representa CE aisladas cultivadas utilizando el protocolo descrito que muestra una morfología distinta similar a un adoquín con células contaminantes mínimas.
La expresión del marcador EC cadherina endotelial vascular se confirmó mediante inmunofluorescencia que visualiza las uniones de célula a célula. Aproximadamente el 80% de las células eran CD31 positivas, lo que indica que las CE arteriales mesentéricas humanas constituían la mayor parte de la población de células recién aisladas. Los aislamientos fallidos dan como resultado células con morfología alterada, que potencialmente expresan marcadores mesenquimales o se alargan y se asemejan a un estado fibroblástico.
La figura muestra una aproximación y proyección de variedad uniforme representativa aislada para la arteria mesentérica utilizando el protocolo actual para la secuenciación de ARN unicelular en ECS arterial mesentérico humano aislado, con un 34% de células agrupadas como CE utilizando PECAM1 y VWF como marcadores. El ARN de alta calidad debe mostrar un número de integridad de ARN no inferior a seis, y la proporción de bandas de ARN ribosómico 28S a 18S es lo más cercana posible a dos. Se puede observar una debilidad o ausencia de estas señales de ARN ribosómico cuando los ARN se degradan.
La tinción de hematoxilina y eosina visualizó la morfología del vaso, lo que permitió identificar regiones de interés. La expresión génica se visualizó con anclaje espacial en el vaso teñido de hematoxilina y eosina. Maneje el tejido y el stock celular con cuidado para mantener la calidad del ARN, especialmente para el perfil del transcriptoma espacial.
Asegúrese de que el tejido se coloque sobre hielo seco para reducir la degradación del ARN. Además, maneje las secciones y el tejido con instrumentos preenfriados. Hemos podido explorar los cambios en la expresión del gen EC, incluidos los LncRNAs en contexto a la diabetes y su interacción con otros tipos de células.
Podemos deducir la ubicación de estos cambios transcriptómicos utilizando técnicas de perfil del transcriptoma espacial.
