En la mayoría de los casos, la mutagénesis convencional dirigida al sitio no es apropiada para estudiar el papel funcional de las prolinas en las proteínas. Aquí, presentamos un método para incorporar análogos de prolina como aminoácidos no canónicos en proteínas sintetizadas ribosómicamente para investigar el papel de los residuos de prolina en el plegamiento y la función de las proteínas. La sustitución de prolinas por aminoácidos estándar es un enfoque arriesgado.
La incorporación de análogos de prolina permite un tipo de cirugía molecular. En otras palabras, introduce cambios moleculares sutiles para influir racionalmente y manipular las propiedades de las proteínas. Dado que los residuos de prolina desempeñan un papel esencial en la estabilidad de los andamios de proteínas, nuestra tecnología podría ser útil para comprender las razones detrás de los déficits de plegamiento de proteínas, que subyacen a ciertos estados patológicos en los seres humanos.
Las alteraciones de proteínas inducidas por los reemplazos de prolina tienen implicaciones para la ingeniería biotecnológica de enzimas y brindan oportunidades para mejorar la traducción o plegamiento de proteínas ribosómicas. Este método no requiere equipos especiales ni instrumentación costosa. Se debe tener especial cuidado con los pasos del protocolo, en los que la prolina nativa se agota de los cultivos de E. coli antes de la adición de análogos de prolina.
Para comenzar la producción de las proteínas fluorescentes con prolina nativa, inocule 200 mililitros de medio NMM fresco en un matraz Erlenmeyer de dos litros con dos mililitros del cultivo nocturno. Incubar las células a 37 grados Centígrados en un agitador orbital a 220 RPM durante aproximadamente 3,5 horas. Durante la incubación, mida la densidad óptica a 600 nanómetros en un espectrofotómetro cada 30 minutos.
Cuando la densidad óptica alcance 0.7, gire hacia abajo la suspensión celular y decante suavemente el sobrenadante en desechos. Luego, lave las células resuspiéndolos en 50 mililitros de NMM helado sin aminoácidos o NMM sin prolina. Haga girar las células de nuevo y decante el sobrenadante en residuos.
A continuación, resuspenda el pellet celular mediante pipeteo suave en 200 mililitros de NMM sin prolina y complementado con ampicilina en un matraz Erlenmeyer de dos litros, e incube las células en un agitador orbital durante 30 minutos para permitir el agotamiento completo de la prolina. Después de la incubación, agregue un volumen apropiado de L-prolina o los análogos de prolina de las soluciones madre de 50 milimolares para obtener una concentración final de un milimolar en la suspensión celular. A continuación, induzca la expresión de proteínas diana mediante la adición de IPTG de 500 micromolares a partir de una solución madre de un molar.
Exprese la proteína objetivo durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador orbital y mida la densidad óptica al día siguiente. Recoger las células bacterianas por centrifugación y decantar el sobrenadante en residuos. Luego, lave las células mediante un pipeteo cuidadoso en 50 mililitros de tampón de unión que contenga 10% de glicerol.
Vuelva a girar las células, decante el sobrenadante y almacene el gránulo celular en un tubo de 50 mililitros a menos 20 u 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Antes de evaluar la emisión de fluorescencia, realice un SDS-PAGE para asegurarse de que la pureza de la muestra esté por encima del 95% Luego, ajuste las muestras de cada variante de proteína purificada a una concentración de 0.3 micromoles, tomando como referencia el valor de absorbancia calculado en la longitud de onda apropiada. Asegúrese de que el volumen aproximado de la muestra final sea de 200 microlitros.
Deje que las muestras diluidas se equilibren a temperatura ambiente. Después de una hora, transfiera las muestras a una cubeta de cuarzo de un centímetro y mida el espectro de emisión de fluorescencia de las muestras utilizando un espectrómetro de fluorescencia. Para inducir la desnaturalización, diluya las muestras de cada variante de proteína veinte veces agregando los dos microlitros de muestras de 300 micromolares a 18 microlitros de tampón PBS 1.11X que contiene urea molar 8.89 y TDT milimolar 5.56.
Incubar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, diluya las muestras 100 veces agregando 1, 980 microlitros de PBS que contienen TDT de cinco milimolares para inducir la renaturalización y transfiera inmediatamente 200 microlitros de las muestras a una cubeta de cuarzo de un centímetro. Inserte la cubeta de cuarzo en un espectrómetro de fluorescencia apropiado y monitoree el repliegue de proteínas adquiriendo un espectro de fluorescencia cada tres segundos durante 30 minutos.
Transfiera las muestras de repliegue en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, luego cierre la tapa y almacene las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir el repliegue completo de las variantes de EGFP. Después de 24 horas, mida la emisión de fluorescencia de las muestras de proteínas replegadas utilizando la misma longitud de onda de excitación que antes para capturar el punto final temporal de la recuperación de fluorescencia. Los gránulos de células que expresan proteínas nativas y variantes que llevan S-fluoroprolina y dehidroprolina tenían un color brillante típico debido al cromóforo intacto.
En contraste, las variantes que contenían R-fluoroprolina y difluoroprolina permanecieron incoloras, lo que indica un plegamiento incorrecto y la deposición de proteína desplegada en los cuerpos de inclusión. El análisis SDS-PAGE verificó la presencia de proteínas insolubles que contienen R-fluoroprolina. En contraste, se encontraron proteínas nativas y variantes portadoras de S-fluoroprolina y dehidroprolina en las fracciones solubles.
En el análisis de cromatografía líquida/espectrometría de masas, cada reemplazo de prolina con S-fluoroprolina produjo un cambio positivo de 18 dalton por residuo de prolina, mientras que el reemplazo con dehidroprolina produjo un cambio negativo de dos daltons por residuo. En los espectros de absorción y emisión de luz, la absorbancia del cromóforo se encontró a 488 nanómetros para EGFP y 493 nanómetros para NowGFP. En KillerOrange, la región de absorbancia del cromóforo comprendía dos bandas correspondientes a dos posibles estados de configuración y carga del cromóforo complejo.
Además, los espectros de fluorescencia registrados tras la excitación en las correspondientes longitudes de onda de absorbancia máxima implicaban que los análogos no alteraban el entorno químico de los cromóforos. En experimentos de repliegue, la fluorescencia crotófora EGFP nativa se recuperó parcialmente, aunque la fluorescencia específica de triptófano fue mayor después de la renaturalización. Se observó un comportamiento similar para la variante que contiene dehidroprolina.
En la S-fluoroprolina que contiene EGFP, se observó un resultado similar con una excitación de 295 nanómetros, mientras que la fluorescencia se recuperó en una medida mucho mayor a 488 nanómetros. Solo las variantes de EGFP mostraron una cinética de repliegue rápido con una recuperación de emisiones de triptófano que fue dos veces más rápida en comparación con la emisión de cromóforos. Se deben utilizar cultivos bacterianos frescos con medios de crecimiento adecuados.
Las técnicas estériles y el monitoreo regular del crecimiento del cultivo también son requisitos previos importantes para el éxito del experimento. Este método es aplicable a la ingeniería de proteínas, ya que permite estudiar el papel de otros aminoácidos canónicos. Para esto, se necesitan cepas adecuadas de E. coli auxotrófica y análogos de aminoácidos.
Se requiere espectrometría de masas de proteínas enteras como evidencia analítica para confirmar la incorporación de análogos de aminoácidos no canónicos. El método SPI para la incorporación de análogos de prolina nos permite manipular la columna vertebral de la proteína directamente, y ofrece ventajas para el diseño racional y la producción facilitada de proteínas a través de la estabilización global y la mejora de la traslación o plegamiento ribosómico.
