Dans la plupart des cas, la mutagénèse conventionnelle dirigée par site n’est pas appropriée pour étudier le rôle fonctionnel des prolines dans les protéines. Ici, nous présentons une méthode pour incorporer des analogues de la proline en tant qu’acides aminés non canoniques dans des protéines synthétisées ribosomiquement afin d’étudier le rôle des résidus de proline sur le repliement et la fonction des protéines. La substitution des prolines par des acides aminés standard est une approche risquée.
L’incorporation d’analogues de la proline permet une sorte de chirurgie moléculaire. En d’autres termes, il introduit des changements moléculaires subtils pour influencer rationnellement et manipuler les propriétés des protéines. Étant donné que les résidus de proline jouent un rôle essentiel dans la stabilité des échafaudages protéiques, notre technologie pourrait être utile pour comprendre les raisons des déficits de repliement des protéines, qui sous-tendent certains états pathologiques chez l’homme.
Les altérations protéiques induites par les remplacements de proline ont des implications pour l’ingénierie biotechnologique des enzymes et offrent des possibilités d’amélioration de la traduction ou du repliement des protéines ribosomiques. Cette méthode ne nécessite pas d’équipement spécial et d’instrumentation coûteuse. Des précautions particulières doivent être prises avec les étapes du protocole, dans lesquelles la proline native est épuisée à partir de cultures d’E. coli avant l’ajout d’analogues de la proline.
Pour commencer la production des protéines fluorescentes avec de la proline native, inoculez 200 millilitres de milieu NMM frais dans une fiole d’Erlenmeyer de deux litres avec deux millilitres de la culture de nuit. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital à 220 tr / min pendant environ 3,5 heures. Pendant l’incubation, mesurez la densité optique à 600 nanomètres dans un spectrophotomètre toutes les 30 minutes.
Lorsque la densité optique atteint 0,7, faites tourner la suspension de la cellule et décantez doucement le surnageant dans les déchets. Ensuite, lavez les cellules en les resusmettant dans 50 millilitres de NMM glacé sans aucun acide aminé ou de NMM sans proline. Faites tourner à nouveau les cellules et décantez le surnageant en déchets.
Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule par pipetage doux dans 200 millilitres de NMM sans proline et complétée par de l’ampicilline dans une fiole d’Erlenmeyer de deux litres, et incuber les cellules dans un agitateur orbital pendant 30 minutes pour permettre l’épuisement complet de la proline. Après l’incubation, ajouter un volume approprié de L-proline ou des analogues de la proline à partir des solutions mères de 50 millimolaires pour obtenir une concentration finale d’un millimolaire dans la suspension cellulaire. Ensuite, induire l’expression de la protéine cible en ajoutant de l’IPTG 500 micromolaires à partir d’une solution mère à une molaire.
Exprimez la protéine cible pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital et mesurez la densité optique le lendemain. Recueillir les cellules bactériennes par centrifugation et décanter le surnageant dans les déchets. Ensuite, lavez les cellules en pipetant soigneusement dans 50 millilitres de tampon de liaison contenant 10% de glycérol.
Faites tourner à nouveau les cellules, décantez le surnageant et stockez la pastille cellulaire dans un tube de 50 millilitres à moins 20 ou 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Avant d’évaluer l’émission de fluorescence, effectuez une SDS-PAGE pour vous assurer que la pureté de l’échantillon est supérieure à 95 %Ensuite, ajustez les échantillons de chaque variante de protéine purifiée à une concentration de 0,3 micromoles, en prenant la valeur d’absorbance calculée à la longueur d’onde appropriée comme référence. Assurez-vous que le volume final approximatif de l’échantillon est de 200 microlitres.
Laisser les échantillons dilués s’équilibrer à température ambiante. Après une heure, transférez les échantillons dans une cuvette de quartz d’un centimètre et mesurez le spectre d’émission de fluorescence des échantillons à l’aide d’un spectromètre de fluorescence. Pour induire la dénaturation, diluer vingt fois les échantillons de chaque variante de protéine en ajoutant les deux microlitres d’échantillons de 300 micromolaires à 18 microlitres de tampon PBS 1,11X contenant de l’urée 8,89 molaires et une TNT 5,56 millimolaires.
Incuber les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, diluez les échantillons 100 fois en ajoutant 1 980 microlitres de PBS contenant une TNT de cinq millimolaires pour induire la renaturation et transférez immédiatement 200 microlitres des échantillons dans une cuvette de quartz d’un centimètre. Insérez la cuvette de quartz dans un spectromètre de fluorescence approprié et surveillez le repliement des protéines en acquérant un spectre de fluorescence toutes les trois secondes pendant 30 minutes.
Transférez les échantillons de repli dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis fermez le couvercle et stockez les échantillons à température ambiante dans l’obscurité pour permettre un repliement complet des variantes EGFP. Après 24 heures, mesurez l’émission de fluorescence des échantillons de protéines repliés en utilisant la même longueur d’onde d’excitation qu’auparavant pour capturer le point final temporel de la récupération de fluorescence. Les granulés de cellules exprimant des protéines natives et de variantes contenant de la S-fluoroproline et de la déshydroproline avaient une couleur vive typique en raison du chromophore intact.
En revanche, les variantes contenant de la R-fluoroproline et de la difluoroproline sont restées incolores, indiquant un mauvais repliement et un dépôt de protéines dépliées dans les corps d’inclusion. L’analyse SDS-PAGE a vérifié la présence de protéines insolubles contenant de la R-fluoroproline. En revanche, des protéines natives et des variantes contenant de la S-fluoroproline et de la déshydroproline ont été trouvées dans les fractions solubles.
Dans l’analyse par chromatographie liquide/spectrométrie de masse, chaque remplacement de la proline par la S-fluoroproline a produit un décalage positif de 18 dalton par résidu de proline, tandis que le remplacement par la déshydroproline a produit un décalage négatif de deux daltons par résidu. Dans les spectres d’absorption et d’émission de lumière, l’absorbance des chromophores a été trouvée à 488 nanomètres pour EGFP et à 493 nanomètres pour NowGFP. Dans KillerOrange, la région d’absorbance du chromophore comprenait deux bandes correspondant à deux états de configuration et de charge possibles du chromophore complexe.
En outre, les spectres de fluorescence enregistrés lors de l’excitation aux longueurs d’onde d’absorbance maximale correspondantes impliquaient que les analogues ne modifiaient pas l’environnement chimique des chromophores. Dans les expériences de repliement, la fluorescence native du chromophore EGFP s’est partiellement rétablie, bien que la fluorescence spécifique au tryptophane ait été plus grande après la renaturation. Un comportement similaire a été observé pour la variante contenant de la déshydroproline.
Dans la S-fluoroproline contenant de l’EGFP, un résultat similaire a été observé avec une excitation de 295 nanomètres, tandis que la fluorescence s’est rétablie dans une mesure beaucoup plus élevée à 488 nanomètres. Seules les variantes egFP ont montré une cinétique de repliement rapide, la récupération de l’émission de tryptophane étant deux fois plus rapide que l’émission de chromophore. Des cultures bactériennes fraîches avec des milieux de croissance appropriés doivent être utilisées.
Les techniques stériles et le suivi régulier de la croissance de la culture sont également des conditions préalables importantes au succès de l’expérience. Cette méthode est applicable à l’ingénierie des protéines, car elle permet d’étudier le rôle d’autres acides aminés canoniques. Pour cela, des souches d’E. coli auxotrophes appropriées et des analogues d’acides aminés sont nécessaires.
La spectrométrie de masse de protéines entières est nécessaire comme preuve analytique pour confirmer l’incorporation d’analogues d’acides aminés non canoniques. La méthode SPI pour incorporer des analogues de la proline nous permet de manipuler directement l’épine dorsale des protéines et offre des avantages pour une conception rationnelle et une production facilitée de protéines grâce à la stabilisation globale et à l’amélioration de la traduction ou du repliement ribosomique.
