In den meisten Fällen ist die konventionelle ortsgerichtete Mutagenese nicht geeignet, die funktionelle Rolle von Prolinen in Proteinen zu untersuchen. Hier stellen wir eine Methode vor, um Prolinanaloga als nicht-kanonische Aminosäuren in ribosomal synthetisierte Proteine zu integrieren, um die Rolle von Prolinresten auf die Proteinfaltung und -funktion zu untersuchen. Die Substitution von Prolinen durch Standard-Aminosäuren ist ein riskanter Ansatz.
Der Einbau von Prolin-Analoga erlaubt eine Art molekulare Chirurgie. Mit anderen Worten, es führt subtile molekulare Veränderungen ein, um Proteineigenschaften rational zu beeinflussen und zu manipulieren. Da Prolinreste eine wesentliche Rolle für die Stabilität von Proteingerüsten spielen, könnte unsere Technologie hilfreich sein, um die Gründe für Proteinfaltungsdefizite zu verstehen, die bestimmten pathologischen Zuständen beim Menschen zugrunde liegen.
Die durch Prolinersatz induzierten Proteinveränderungen haben Auswirkungen auf die biotechnologische Entwicklung von Enzymen und bieten Möglichkeiten zur Verbesserung der ribosomalen Proteintranslation oder -faltung. Diese Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und teure Instrumentierung. Besondere Vorsicht ist geboten bei Protokollschritten, bei denen natives Prolin vor der Zugabe von Prolinanaloga aus E.coli-Kulturen erschöpft wird.
Um mit der Herstellung der fluoreszierenden Proteine mit nativem Prolin zu beginnen, impfen Sie 200 Milliliter frisches NMM-Medium in einem Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben mit zwei Millilitern der Nachtkultur. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler bei 220 U / min für ca. 3,5 Stunden. Messen Sie während der Inkubation alle 30 Minuten die optische Dichte bei 600 Nanometern in einem Spektralphotometer.
Wenn die optische Dichte 0,7 erreicht, drehen Sie die Zellsuspension herunter und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig zu Abfall. Waschen Sie dann die Zellen, indem Sie 50 Milliliter eiskaltes NMM ohne Aminosäuren oder NMM ohne Prolin resuspendieren. Drehen Sie die Zellen erneut und dekantieren Sie den Überstand zu Abfall.
Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanftes Pipettieren in 200 Milliliter NMM ohne Prolin und ergänzt mit Ampicillin in einem Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben und inkubieren Sie die Zellen in einem Orbitalschüttler für 30 Minuten, um die vollständige Erschöpfung von Prolin zu ermöglichen. Nach der Inkubation fügen Sie ein geeignetes Volumen entweder L-Prolin oder der Prolinanaloga aus den 50-Millimol-Stammlösungen hinzu, um eine einmillimolare Endkonzentration in der Zellsuspension zu erhalten. Als nächstes induzieren Sie die Zielproteinexpression durch Zugabe von 500-mikromolärem IPTG aus einer einmolaren Stammlösung.
Drücken Sie das Zielprotein über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalshaker aus und messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte. Sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation und dekantieren Sie den Überstand zu Abfall. Dann waschen Sie die Zellen durch sorgfältiges Pipettieren in 50 Milliliter Bindungspuffer, der 10% Glycerin enthält.
Drehen Sie die Zellen erneut, dekantieren Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet in einem 50-Milliliter-Röhrchen bei minus 20 oder 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Bevor Sie die Fluoreszenzemission auswerten, führen Sie eine SDS-PAGE durch, um sicherzustellen, dass die Probenreinheit über 95% liegtDann passen Sie die Proben jeder gereinigten Proteinvariante auf eine Konzentration von 0,3 Mikromol an und nehmen Sie den berechneten Absorptionswert bei der entsprechenden Wellenlänge als Referenz. Stellen Sie sicher, dass das ungefähre endgültige Probenvolumen 200 Mikroliter beträgt.
Lassen Sie die verdünnten Proben bei Raumtemperatur ausgleichen. Nach einer Stunde geben Sie die Proben in eine einen Zentimeter große Quarzküvette und messen das Fluoreszenzemissionsspektrum der Proben mit einem Fluoreszenzspektrometer. Um eine Denaturierung zu induzieren, verdünnen Sie die Proben jeder Proteinvariante um das Zwanzigfache, indem Sie die zwei Mikroliter 300-Mikromolaren Proben zu 18 Mikrolitern 1,11-fachem PBS-Puffer mit 8,89-molarem Harnstoff und 5,56-Millimolar-DTT hinzufügen.
Inkubieren Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Verdünnen Sie dann die Proben um das 100-fache, indem Sie 1.980 Mikroliter PBS mit fünf-millimolärem DVB-t hinzufügen, um eine Renaturierung zu induzieren, und übertragen Sie sofort 200 Mikroliter der Proben in eine einen Zentimeter große Quarzküvette. Setzen Sie die Quarzküvette in ein geeignetes Fluoreszenzspektrometer ein und überwachen Sie die Proteinfaltung, indem Sie alle drei Sekunden über 30 Minuten ein Fluoreszenzspektrum erfassen.
Die nachgefalteten Proben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, dann den Deckel schließen und die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern, um eine vollständige Nachfaltung der EGFP-Varianten zu ermöglichen. Messen Sie nach 24 Stunden die Fluoreszenzemission der gefalteten Proteinproben mit der gleichen Anregungswellenlänge wie zuvor, um den zeitlichen Endpunkt der Fluoreszenzwiederherstellung zu erfassen. Pellets aus Zellen, die natives Protein exprimierten, und Varianten, die S-Fluorprolin und Dehydroprolin enthielten, hatten aufgrund des intakten Chromophors eine typische helle Farbe.
Im Gegensatz dazu blieben Varianten, die R-Fluorprolin und Difluorprolin enthielten, farblos, was auf eine Fehlfaltung und Ablagerung von entfaltetem Protein in Einschlusskörpern hinweist. Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte das Vorhandensein von unlöslichen R-Fluorprolin-haltigen Proteinen. Im Gegensatz dazu wurden native Proteine und S-Fluorprolin und dehydroprolinhaltige Varianten in den löslichen Fraktionen gefunden.
In der Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie-Analyse erzeugte jeder Prolinersatz durch S-Fluorprolin eine positive 18-Dalton-Verschiebung pro Prolinrest, während der Ersatz durch Dehydroprolin eine negative Verschiebung von zwei Dalton pro Rückstand erzeugte. In Lichtabsorptions- und Emissionsspektren wurde die Chromophorabsorption bei 488 Nanometern für EGFP und 493 Nanometern für NowGFP gefunden. In KillerOrange umfasste der Chromophor-Absorptionsbereich zwei Banden, die zwei möglichen Konfigurations- und Ladungszuständen des komplexen Chromophors entsprachen.
Darüber hinaus implizierten Fluoreszenzspektren, die bei Anregung bei den entsprechenden maximalen Absorptionswellenlängen aufgezeichnet wurden, dass die Analoga die chemische Umgebung der Chromophore nicht veränderten. In Refolding-Experimenten erholte sich die native EGFP-Chromophorfluoreszenz teilweise, obwohl die Tryptophan-spezifische Fluoreszenz nach der Renaturierung größer war. Ein ähnliches Verhalten wurde für die Variante beobachtet, die Dehydroprolin enthielt.
Bei EGFP-haltigem S-Fluorprolin wurde ein ähnliches Ergebnis mit einer 295-Nanometer-Anregung beobachtet, während sich die Fluoreszenz bei 488 Nanometern in viel höherem Maße erholte. Nur die EGFP-Varianten zeigten eine schnelle Refolding-Kinetik, wobei die Tryptophan-Emissionsrückgewinnung im Vergleich zur Chromophoremission doppelt so schnell war. Es müssen frische Bakterienkulturen mit geeigneten Nährmedien verwendet werden.
Sterile Techniken und die regelmäßige Überwachung des Kulturwachstums sind ebenfalls wichtige Voraussetzungen für den Erfolg des Experiments. Diese Methode ist auf das Protein-Engineering anwendbar, da sie es ermöglicht, die Rolle anderer kanonischer Aminosäuren zu untersuchen. Hierfür werden geeignete auxotrophe E.coli-Stämme und Aminosäureanaloga benötigt.
Die Massenspektrometrie ganzer Proteine ist als analytischer Nachweis erforderlich, um den Einbau von nicht-kanonischen Aminosäureanaloga zu bestätigen. Die SPI-Methode zur Integration von Prolinanaloga ermöglicht es uns, das Proteinrückgrat direkt zu manipulieren, und bietet Vorteile für ein rationales Design und eine erleichterte Produktion von Proteinen durch globale Stabilisierung und Verbesserung der ribosomalen Translation oder Faltung.
