Na maioria dos casos, a mutagênese convencional dirigida ao local não é apropriada para estudar o papel funcional das prolinas em proteínas. Aqui, apresentamos um método para incorporar análogos prolinas como aminoácidos não canônicos em proteínas ribosicamente sintetizadas para investigar o papel dos resíduos de prolina em dobras e funções de proteínas. A substituição de prolines por aminoácidos padrão é uma abordagem arriscada.
A incorporação de análogos prolinas permite uma espécie de cirurgia molecular. Em outras palavras, introduz mudanças moleculares sutis para influenciar racionalmente e manipular propriedades proteicas. Uma vez que os resíduos de prolinação desempenham um papel essencial na estabilidade dos andaimes proteicos, nossa tecnologia pode ser útil para entender as razões por trás dos déficits de dobramento de proteínas, que estão por trás de certos estados patológicos em humanos.
As alterações proteicas induzidas por substituições prolinas têm implicações para a engenharia biotecnológica das enzimas e oferecem oportunidades para o aprimoramento da tradução ou dobra da proteína ribossômica. Este método não requer equipamentos especiais e instrumentação cara. Deve-se tomar cuidado especial com as etapas de protocolo, nas quais a prolina nativa é esgotada das culturas E.coli antes da adição de análogos proline.
Para iniciar a produção das proteínas fluorescentes com prolina nativa, inocular 200 mililitros de meio NMM fresco em um frasco erlenmeyer de dois litros com dois mililitros da cultura da noite para o dia. Incubar as células a 37 graus Celsius em um agitador orbital a 220 RPM por aproximadamente 3,5 horas. Durante a incubação, meça a densidade óptica em 600 nanômetros em um espectotômetro a cada 30 minutos.
Quando a densidade óptica atingir 0,7, gire a suspensão celular e decante suavemente o supernatante em resíduo. Em seguida, lave as células reutilizando em 50 mililitros de NMM gelado sem aminoácidos ou NMM sem prolina. Gire as células novamente e decante o supernatante em lixo.
Em seguida, resuspenque a pelota celular por tubulação suave em 200 mililitros de NMM sem proline e complementado com ampicilina em um frasco Erlenmeyer de dois litros, e incubar as células em um agitador orbital por 30 minutos para permitir o esgotamento completo da prolina. Após a incubação, adicione um volume apropriado de L-proline ou os análogos prolinas das soluções de estoque de 50 mililitros para obter uma concentração final de um mililitro na suspensão celular. Em seguida, induzir a expressão proteica alvo adicionando 500 iPTG de 500 micromolar de uma solução de estoque de um molar.
Expresse a proteína alvo durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador orbital e meça a densidade óptica no dia seguinte. Recolher as células bacterianas por centrifugação e decantar o supernante em resíduos. Em seguida, lave as células com tubos cuidadosos em 50 mililitros de tampão de ligação contendo 10% de glicerol.
Gire as células novamente, decante o supernante, e armazene a pelota celular em um tubo de 50 mililitros a menos 20 ou 80 graus Celsius até usar mais. Antes de avaliar a emissão de fluorescência, realize um SDS-PAGE para garantir que a pureza da amostra esteja acima de 95%, em seguida, ajuste as amostras de cada variante proteica purificada para uma concentração de 0,3 micromoles, tomando o valor de absorção calculado no comprimento de onda apropriado como referência. Certifique-se de que o volume final aproximado da amostra seja de 200 microliters.
Deixe as amostras diluídas equilibrarem-se à temperatura ambiente. Após uma hora, transfira as amostras para um cuvette de quartzo de um centímetro e meça o espectro de emissão de fluorescência das amostras usando um espectrômetro de fluorescência. Para induzir a desnaturação, dilui as amostras de cada variante proteica vinte vezes adicionando os dois microliteres de 300 amostras de micromolar a 18 microliters de 1,11X PBS tampão contendo 8,89-molar ureia e 5,56 mililitros DTT.
Incubar as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, diluir as amostras 100 vezes adicionando 1.980 microliters de PBS contendo DTT de cinco mililitros para induzir renaturação e transferir imediatamente 200 microliters das amostras em um cuvette de quartzo de um centímetro. Insira o cuvette de quartzo em um espectrômetro de fluorescência apropriado e monitore a redobramento da proteína adquirindo um espectro de fluorescência a cada três segundos ao longo de 30 minutos.
Transfira as amostras de reabascamento em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro, em seguida, feche a tampa e armazene as amostras à temperatura ambiente no escuro para permitir o reabascamento completo das variantes EGFP. Após 24 horas, meça a emissão de fluorescência das amostras de proteína reamostos usando o mesmo comprimento de onda de excitação de antes para capturar o ponto final temporal da recuperação da fluorescência. Pelotas de células expressando proteína nativa e variantes com S-fluoroproline e dehydroproline tinham uma cor brilhante típica devido ao cromoforo intacto.
Em contraste, variantes contendo R-fluoroproline e difluoroprolina permaneceram incolores, indicando dobras erradas e deposição de proteína desdobrada em corpos de inclusão. A análise SDS-PAGE verificou a presença de proteínas insolúveis contendo r-fluoroprolina. Em contraste, proteínas nativas e variantes de s-fluoroprolina e dehydroprolina foram encontradas nas frações solúveis.
Na análise de cromatografia líquida/espectrometria de massa, cada substituição de proline por S-fluoroproline produziu uma mudança positiva de 18-dalton por resíduo de prolina, enquanto a substituição por dehidroprolina produziu uma mudança negativa de dois daltons por resíduo. Em espectrância de absorção e emissão de luz, a absorção de cromoforeiros foi encontrada em 488 nanômetros para EGFP e 493 nanômetros para NowGFP. Em KillerOrange, a região de absorção de cromoforeiro era composta por duas bandas correspondentes a dois possíveis estados configuracionais e de carga do complexo cromoforeiro.
Além disso, espectros de fluorescência registrados após excitação nos comprimentos de onda máximo de absorção correspondentes implicavam que os análogos não alteravam o ambiente químico dos cromóforos. Em experimentos de reamosscação, a fluorescência cromopária nativa de EGFP recuperou-se parcialmente, embora a fluorescência específica do triptofano tenha sido maior após a renaturação. Foi observado comportamento semelhante para a variante contendo dehidroprolina.
Em S-fluoroproline contendo EGFP, um resultado semelhante foi observado com uma excitação de 295 nanômetros, enquanto a fluorescência recuperou-se em uma extensão muito maior em 488 nanômetros. Apenas as variantes EGFP mostraram cinética de remassagem rápida com a recuperação de emissões de triptofano sendo duas vezes mais rápida em comparação com a emissão de cromoforeiro. Devem ser utilizadas culturas bacterianas frescas com meios de crescimento adequados.
Técnicas estéreis e monitoramento regular do crescimento da cultura também são importantes pré-requisitos para o sucesso do experimento. Este método é aplicável à engenharia proteica, pois permite estudar o papel de outros aminoácidos canônicos. Para isso, são necessárias cepas auxotróficas adequadas de E.coli e análogos de aminoácidos.
A espectrometria de massa de proteínas inteiras é necessária como evidência analítica para confirmar a incorporação de análogos de aminoácidos não canônicos. O método SPI para incorporar análogos prolinas permite manipular diretamente o backbone proteico, e oferece vantagens para o design racional e facilitar a produção de proteínas através da estabilização global e melhoria da tradução ribossômica ou dobrável.
