ברוב המקרים, מוטגנזה קונבנציונלית מכוונת אתר אינה מתאימה לחקר התפקיד התפקודי של פרולינים בחלבונים. כאן אנו מציגים שיטה לשילוב אנלוגים פרולין כחומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים מסונתזים ריבוזומלית כדי לחקור את תפקידם של שאריות פרולין על קיפול ותפקוד חלבונים. החלפת פרולינה בחומצות אמינו סטנדרטיות היא גישה מסוכנת.
שילוב של אנלוגים פרולין מאפשר סוג של ניתוח מולקולרי. במילים אחרות, הוא מכניס שינויים מולקולריים עדינים כדי להשפיע באופן רציונלי על תכונות החלבון ולתפעל אותן. מאחר ששאריות פרולין ממלאות תפקיד חיוני ביציבותם של פיגומי חלבונים, הטכנולוגיה שלנו יכולה לעזור להבין את הסיבות מאחורי ליקויים בקיפול חלבונים, העומדים בבסיסם של מצבים פתולוגיים מסוימים בבני אדם.
לשינויי החלבונים המושרים על ידי תחליפי פרולין יש השלכות על ההנדסה הביוטכנולוגית של אנזימים והם מספקים הזדמנויות לשיפור תרגום או קיפול של חלבונים ריבוזומליים. שיטה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ומכשור יקר. יש לנקוט בזהירות מיוחדת עם צעדי פרוטוקול, שבהם פרולין מקורי מתרוקן מתרביות E.coli לפני הוספת אנלוגים פרולין.
כדי להתחיל בייצור של חלבונים פלואורסצנטיים עם פרולין מקומי, לחסן 200 מיליליטרים של מדיום NMM טרי בבקבוקון Erlenmeyer של שני ליטר עם שני מיליליטרים של תרבית הלילה. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-220 סל"ד למשך כ-3.5 שעות. במהלך הדגירה, יש למדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר בספקטרופוטומטר כל 30 דקות.
כאשר הצפיפות האופטית מגיעה ל-0.7, סובבו מטה את תרחיף התא וצימצמו בעדינות את הסופרנטנט לפסולת. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי החייאה ב-50 מיליליטרים של NMM קר כקרח ללא חומצות אמינו או NMM ללא פרולין. סובבו שוב את התאים ותפרקו את ה-supernatant לפסולת.
לאחר מכן, יש לבצע החייאה של גלולת התאים על ידי צנרת עדינה ב-200 מיליליטרים של NMM ללא פרולין ולהשלים עם אמפיצילין בבקבוקון ארלנמאייר בנפח שני ליטרים, ולדגום את התאים בשייקר מסלולי למשך 30 דקות כדי לאפשר דלדול מוחלט של הפרולין. לאחר הדגירה, הוסף נפח מתאים של L-proline או אנלוגים פרולין מתמיסות המלאי של 50 מילימולאר כדי לקבל ריכוז סופי של מילימולר אחד בהשעיית התא. לאחר מכן, לגרום לביטוי חלבון יעד על ידי הוספת IPTG של 500 מיקרומולר מתמיסת מלאי טוחנת אחת.
מבטאים את חלבון המטרה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ומודדים את הצפיפות האופטית למחרת. לאסוף את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה ולפרק את הסופרנטנט לפסולת. לאחר מכן, לשטוף את התאים על ידי צנרת זהירה ב 50 מיליליטרים של מאגר קישור המכיל 10% גליצרול.
סובבו שוב את התאים, נקו את הסופרנאטנט, ואחסנו את גלולת התא בצינור של 50 מיליליטר במינוס 20 או 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לפני הערכת פליטת פלואורסצנציה, בצע SDS-PAGE כדי להבטיח שטוהר הדגימה הוא מעל 95% לאחר מכן, התאם את הדגימות של כל וריאנט חלבון מטוהר לריכוז של 0.3 מיקרומולים, תוך לקיחת ערך הספיגה המחושב באורך הגל המתאים כהפניה. ודא שנפח הדגימה הסופי המשוער הוא 200 מיקרוליטרים.
תנו לדגימות המדוללות להתיישב בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, העבירו את הדגימות לקובט קוורץ בקוורץ באורך סנטימטר אחד ומדדו את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של הדגימות באמצעות ספקטרומטר פלואורסצנטי. כדי לגרום לדנטורציה, דיללו את הדגימות של כל וריאנט חלבון פי עשרים על ידי הוספת שני המיקרוליטרים של דגימות 300 מיקרומולריות ל-18 מיקרוליטרים של מאגר PBS 1.11X המכיל אוריאה טוחנות 8.89 ו-5.56 מילימולאר DTT.
הדגירה של הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, דיללו את הדגימות פי 100 על ידי הוספת 1, 980 מיקרוליטרים של PBS המכילים DTT של חמישה מילימולרים כדי לגרום לרנטורציה ולהעביר מיד 200 מיקרוליטרים של הדגימות לקובט קוורץ של סנטימטר אחד. מכניסים את הקובט קוורץ לספקטרומטר פלואורסצנטי מתאים ועוקבים אחר שיפוץ חלבונים על ידי רכישת ספקטרום פלואורסצנטי כל שלוש שניות במשך 30 דקות.
מעבירים את דגימות השיפוץ לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ואז סוגרים את המכסה ומאחסנים את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך כדי לאפשר שיפוץ מלא של גרסאות EGFP. לאחר 24 שעות, מדוד את פליטת הפלואורסצנציה של דגימות החלבון המחודשות באמצעות אותו אורך גל של עירור כמו קודם לכן כדי ללכוד את נקודת הקצה הטמפורלית של התאוששות פלואורסצנטית. לכדורים מתאים המבטאים חלבונים מקומיים ולגרסאות שנשאו S-פלואורופרולין ודהידרופרולין היה צבע בהיר אופייני בשל הכרומופור השלם.
לעומת זאת, וריאנטים המכילים R-פלואורופרולין ודיפלואורופרופרולין נותרו חסרי צבע, מה שמעיד על קיפול שגוי ושקיעה של חלבון נפרש בגופי הכללה. ניתוח SDS-PAGE אימת את נוכחותם של חלבונים המכילים R-fluoroproline בלתי מסיסים. לעומת זאת, חלבונים מקומיים וריאנטים נושאי S-fluoroproline ו-dehydroproline נמצאו בשברים המסיסים.
באנליזה של כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסות, כל החלפת פרולין ב-S-fluoroproline יצרה תזוזה חיובית של 18 דלטון לכל שאריות פרולין, בעוד שהחלפה בדהידרופרולין יצרה תזוזה שלילית של שני דלטונים לכל שאריות. בספקטרום בליעת אור ופליטה, ספיגת כרומופור נמצאה ב-488 ננומטר עבור EGFP ו-493 ננומטר עבור NowGFP. ב-KillerOrange, אזור ספיגת הכרומופורים כלל שני פסים המתאימים לשני מצבי תצורה ומטען אפשריים של הכרומופור המרוכב.
יתר על כן, ספקטרום פלואורסצנטי שנרשם עם עירור באורכי הגל המתאימים לספיגה מקסימלית רמז כי האנלוגיות לא שינו את הסביבה הכימית של הכרומופורים. בניסויים חוזרים, הפלואורסצנציה הטבעית של כרומופור EGFP התאוששה חלקית, אם כי הפלואורסצנציה הספציפית לטריפטופן הייתה גדולה יותר לאחר רנטורציה. התנהגות דומה נצפתה עבור הווריאנט המכיל דהידרופרולין.
ב-S-fluoroproline המכיל EGFP, נצפתה תוצאה דומה עם עירור של 295 ננומטר, בעוד שהפלואורסצנציה התאוששה במידה גבוהה בהרבה ועמדה על 488 ננומטר. רק גרסאות ה-EGFP הראו קינטיקה מהירה של שיפוץ מחדש, כאשר התאוששות פליטת טריפטופן הייתה מהירה פי שניים בהשוואה לפליטת הכרומופורים. יש להשתמש בתרביות חיידקים טריות עם אמצעי גדילה מתאימים.
טכניקות סטריליות וניטור קבוע של צמיחת התרבית הם גם תנאים מוקדמים חשובים להצלחת הניסוי. שיטה זו ישימה להנדסת חלבונים, שכן היא מאפשרת לחקור את תפקידן של חומצות אמינו קנוניות אחרות. לשם כך, יש צורך בזני E.coli auxotrophic מתאימים ואנלוגים של חומצות אמינו.
ספקטרומטריית מסה של חלבונים מלאים נדרשת כראיה אנליטית כדי לאשר את שילובם של אנלוגים של חומצות אמינו שאינן קנוניות. שיטת SPI לשילוב אנלוגים פרולין מאפשרת לנו לתפעל את עמוד השדרה של החלבון ישירות, ומציעה יתרונות לתכנון רציונלי ולהקלה על ייצור חלבונים באמצעות ייצוב גלובלי ושיפור של תרגום או קיפול ריבוזומליים.
