Çoğu durumda, konvansiyonel bölgeye yönelik mutagenez, proteinlerdeki prolinlerin fonksiyonel rolünü incelemek için uygun değildir. Burada, prolin kalıntılarının protein katlanması ve fonksiyonu üzerindeki rolünü araştırmak için prolin analoglarını kanonik olmayan amino asitler olarak ribozomal olarak sentezlenmiş proteinlere dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz. Prolinlerin standart amino asitlerle ikame edilmesi riskli bir yaklaşımdır.
Prolin analoglarının dahil edilmesi bir tür moleküler cerrahiye izin verir. Başka bir deyişle, protein özelliklerini rasyonel olarak etkilemek ve manipüle etmek için ince moleküler değişiklikler getirir. Prolin kalıntıları protein iskelelerinin stabilitesinde önemli bir rol oynadığından, teknolojimiz insanlarda belirli patolojik durumların altında yatan protein katlanma açıklarının arkasındaki nedenleri anlamak için yardımcı olabilir.
Prolin replasmanları tarafından indüklenen protein değişiklikleri, enzimlerin biyoteknolojik mühendisliği için etkilere sahiptir ve ribozomal protein translasyonunun veya katlanmasının geliştirilmesi için fırsatlar sağlar. Bu yöntem özel ekipman ve pahalı enstrümantasyon gerektirmez. Prolin analoglarının eklenmesinden önce doğal prolinin E.coli kültürlerinden tükendiği protokol adımlarına özel dikkat gösterilmelidir.
Doğal prolin ile floresan proteinlerinin üretimine başlamak için, iki litrelik bir Erlenmeyer şişesinde 200 mililitre taze NMM ortamını iki mililitre gece kültürü ile aşılayın. Hücreleri yaklaşık 3.5 saat boyunca 220 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka sırasında, optik yoğunluğu her 30 dakikada bir spektrofotometrede 600 nanometrede ölçün.
Optik yoğunluk 0.7'ye ulaştığında, hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün ve süpernatantı yavaşça boşa ayırın. Daha sonra, hücreleri 50 mililitre buz gibi soğuk NMM'de herhangi bir amino asit olmadan veya prolinsiz NMM içinde yeniden askıya alarak yıkayın. Hücreleri tekrar döndürün ve süpernatantı atıklara boşaltın.
Daha sonra, prolinsiz 200 mililitre NMM'de nazik pipetleme yaparak hücre peletini yeniden askıya alın ve iki litrelik bir Erlenmeyer şişesinde ampisilin ile takviye edin ve prolinin tamamen tükenmesine izin vermek için hücreleri 30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunda bir milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için 50 milimolar stok çözeltilerinden uygun miktarda L-prolin veya prolin analogları ekleyin. Daha sonra, tek molar stok çözeltisinden 500 mikromolar IPTG ekleyerek hedef protein ekspresyonunu indükleyin.
Hedef proteini bir yörüngesel çalkalayıcıda gece boyunca 37 santigrat derecede eksprese edin ve ertesi gün optik yoğunluğu ölçün. Bakteri hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantı atıklara boşaltın. Daha sonra,% 10 gliserol içeren 50 mililitre bağlayıcı tamponda dikkatli pipetleme yaparak hücreleri yıkayın.
Hücreleri tekrar döndürün, süpernatanı boşaltın ve hücre peletini daha fazla kullanana kadar eksi 20 veya 80 santigrat derecede 50 mililitrelik bir tüpte saklayın. Floresan emisyonunu değerlendirmeden önce, numune saflığının% 95'in üzerinde olduğundan emin olmak için bir SDS-PAGE gerçekleştirinArdından, her saflaştırılmış protein varyantının numunelerini, uygun dalga boyunda hesaplanan absorbans değerini referans olarak alarak 0.3 mikromollük bir konsantrasyona ayarlayın. Yaklaşık nihai numune hacminin 200 mikrolitre olduğundan emin olun.
Seyreltilmiş numunelerin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. Bir saat sonra, numuneleri bir santimetrelik kuvars küvete aktarın ve bir floresan spektrometresi kullanarak numunelerin floresan emisyon spektrumunu ölçün. Denatürasyonu indüklemek için, iki mikrolitre 300 mikromolar numuneyi, 8.89-molar üre ve 5.56-milimolar DTT içeren 18 mikrolitre 1.11X PBS tamponuna ekleyerek her protein varyantının numunelerini yirmi kat seyreltin.
Örnekleri beş dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, renatürasyonu indüklemek için beş milimolar DTT içeren 1.980 mikrolitre PBS ekleyerek numuneleri 100 kat seyreltin ve numunelerin 200 mikrolitresini hemen bir santimetrelik kuvars küvete aktarın. Kuvars küvetini uygun bir floresan spektrometresine yerleştirin ve 30 dakika boyunca her üç saniyede bir floresan spektrumu elde ederek protein yeniden katlanmasını izleyin.
Yeniden katlanan numuneleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın, ardından kapağı kapatın ve EGFP varyantlarının tamamen yeniden katlanmasına izin vermek için numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. 24 saat sonra, floresan geri kazanımının zamansal bitiş noktasını yakalamak için daha önce olduğu gibi aynı uyarma dalga boyunu kullanarak yeniden katlanmış protein örneklerinin floresan emisyonunu ölçün. Doğal protein eksprese eden hücrelerden ve S-floroprolin ve dehidroprolin taşıyan varyantlardan elde edilen peletler, bozulmamış kromofor nedeniyle tipik bir parlak renge sahipti.
Buna karşılık, R-floroprolin ve difloroprolin içeren varyantlar renksiz kaldı, bu da inklüzyon cisimlerinde katlanmamış proteinin yanlış katlandığını ve biriktiğini gösterdi. SDS-PAGE analizi, çözünmeyen R-floroprolin içeren proteinlerin varlığını doğruladı. Buna karşılık, çözünür fraksiyonlarda doğal proteinler ve S-floroprolin ve dehidroprolin taşıyan varyantlar bulundu.
Sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi analizinde, S-floroprolin ile yapılan her prolin replasmanı, prolin kalıntısı başına pozitif bir 18-dalton kayması üretirken, dehidroprolin ile değiştirme, kalıntı başına iki daltonluk negatif bir kayma üretti. Işık absorpsiyonu ve emisyon spektrumlarında, EGFP için 488 nanometrede ve NowGFP için 493 nanometrede kromofor emilimi bulundu. KillerOrange'da, kromofor absorbans bölgesi, karmaşık kromoforun iki olası konfigürasyon ve yük durumuna karşılık gelen iki banttan oluşuyordu.
Ayrıca, karşılık gelen maksimum absorbans dalga boylarında uyarma üzerine kaydedilen floresan spektrumları, analogların kromoforların kimyasal ortamını değiştirmediğini ima etti. Yeniden katlama deneylerinde, doğal EGFP kromofor floresansı kısmen iyileşti, ancak triptofana özgü floresan renatürasyondan sonra daha büyüktü. Dehidroprolin içeren varyant için de benzer davranış gözlenmiştir.
EGFP içeren S-floroprolin'de, 295 nanometrelik bir uyarılma ile benzer bir sonuç gözlenirken, floresan 488 nanometrede çok daha yüksek bir dereceye kadar geri kazanıldı. Sadece EGFP varyantları, triptofan emisyon geri kazanımının kromofor emisyonuna kıyasla iki kat daha hızlı olduğu hızlı yeniden katlanan kinetiği gösterdi. Uygun büyüme ortamına sahip taze bakteri kültürleri kullanılmalıdır.
Steril teknikler ve kültür büyümesinin düzenli olarak izlenmesi de deneyin başarısı için önemli ön koşullardır. Bu yöntem, diğer kanonik amino asitlerin rolünü incelemeye izin verdiği için protein mühendisliğine uygulanabilir. Bunun için uygun oksotrofik E.coli suşlarına ve amino asit analoglarına ihtiyaç vardır.
Tüm proteinlerin kütle spektrometrisi, kanonik olmayan amino asit analoglarının dahil edilmesini doğrulamak için analitik kanıt olarak gereklidir. Prolin analoglarını dahil etmek için SPI yöntemi, protein omurgasını doğrudan manipüle etmemize izin verir ve küresel stabilizasyon ve ribozomal translasyonun veya katlamanın iyileştirilmesi yoluyla rasyonel tasarım ve kolaylaştırılmış protein üretimi için avantajlar sunar.
