Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32370135), el Programa de Innovación de la Academia China de Ciencias Agrícolas (CAAS-CSAL-202302), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Escuela Vocacional de Agricultura y Silvicultura de Jiangsu (2021kj29).

1. Cultivo hidropónico estéril de A. thaliana
<ol><li>Prepara las plántulas de A. thaliana .<ol><li>Prepare el medio de cultivo de plántulas de A. thaliana , que consiste en 1/2 medio MS (Murashige y Skoog) con 2% (peso/volumen) de sacarosa y 0,9% (peso/volumen) de agar.</li>
		<li>Vierta el medio de esterilización preparado en placas de Petri cuadradas estériles (13 cm x 13 cm) antes de la solidificación. Evite secar al aire para mantener la humedad.</li>
		<li>Sumerja las semillas de A. thaliana en un tubo de microcentrífuga de 2 mL lleno con 1 mL de agua estéril a 4 °C durante más de 12 h, y luego esterilice las semillas con 1 mL de NaClO al 2% (vol/vol) durante 2 min.</li>
		<li>Lave bien las semillas con agua estéril seis veces para eliminar la solución de NaClO. Siembre las semillas en placas de Petri con medio de agar MS con una punta estéril de 1 mL.</li>
		<li>Selle las placas de Petri con cinta médica transpirable y colóquelas verticalmente en una incubadora ligera para que crezcan durante 1 semana. Ajuste la relación día/noche de la incubadora de luz a 16 h/8 h, mantenga la temperatura a 23 °C y la humedad entre el 40% y el 60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasplante de A. thaliana.<ol><li>Corte agujeros de 5 mm en un tintor celular de 40 μm de tamaño de poro y estériles.</li>
		<li>Trasplante tres plantas de A. thaliana de 7 días de edad a través de los orificios de un colador de células y colóquelas en una placa de 6 pocillos que contenga 3 mL de medio líquido estéril 1/2 MS con 0.5% de sacarosa.</li>
		<li>Coloque las placas de 6 pocillos en una incubadora ligera (Figura 1A) e incube durante 10 días.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultivo e inoculación de bacterias
<ol><li>Prepare la suspensión bacteriana para la inoculación.<ol><li>En el caso de Bacillus velezensis, inocular las células bacterianas en un medio LB estéril e incubar a 37 °C agitando a 170 rpm hasta alcanzar un diámetro exterior de600 de 0,8-1,2.</li>
		<li>Recoja las células bacterianas por centrifugación a 6000 x g durante 2 min y vuelva a suspender las células en tampón PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Repita los pasos de centrifugado y resuspensión 3 veces para eliminar el medio LB y los metabolitos bacterianos.</li>
		<li>Suspender las células bacterianas en un medio fresco de 1/2 MS a una concentración final de OD600 0,01. Inocular las suspensiones de bacterias en las placas de 6 pocillos que cultivan plántulas de A. thaliana , colocar las placas de 6 pocillos en la incubadora de luz y cultivarlas durante 2 días.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medición de bacterias colonizadas en las raíces
<ol><li>Recolecta el tejido de la raíz y coloca las células colonizadas. NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo condiciones gnotobióticas<ol><li>Pesa los tubos de 2 ml y registra el peso como W0.</li>
		<li>Coseche los tejidos de la raíz de A. thaliana cocultivados y lávelos en agua estéril 3 veces. Coloca la raíz sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua.</li>
		<li>Coloque la raíz en el tubo de microcentrífuga pesado, pese las raíces junto con el tubo y regístrelo como W1.</li>
		<li>Agregue 1 mL de PBS a cada tubo y haga vórtice los tubos durante 8 min a la velocidad máxima.</li>
		<li>Diluir las suspensiones con las células bacterianas colonizadas por las raíces recolectadas a 1 x 10-1-1 x 10-4 (de acuerdo con la capacidad de colonización de las bacterias). Extienda las suspensiones bacterianas diluidas en placas que contengan medio de agar LB e incube a 37 °C durante 10 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuente las colonias y normalice los datos.<ol><li>Cuente las colonias bacterianas en placas LB.</li>
		<li>Calcular las UFCs según la dilución correspondiente y normalizar los datos con el peso fresco de la raíz (W1-W 0). Los resultados finales indican el recuento de células bacterianas colonizadas por gramo de raíz a los 2 días después de la inoculación (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
</ol>

Detección de colonización rizobacteriana en Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Para lograr una buena reproducibilidad, hay cuatro pasos críticos para el proceso de detección de colonización de este protocolo. En primer lugar, es necesario asegurarse de que el número de células bacterianas inoculadas sea exactamente el mismo en cada experimento. En segundo lugar, también es necesario controlar la intensidad de limpieza de las bacterias no colonizadas con agua estéril. En tercer lugar, cada proceso de dilución de la muestra debe ser vertiginado antes de realizarse para que la muestra esté en...

Existen métodos cuantitativos y cualitativos para detectar la colonización de la rizosfera por una sola cepa bacteriana. Para el método cualitativo, se debe utilizar una cepa que exprese fluorescencia constitutivamente, y la distribución e intensidad de la fluorescencia debe examinarse con microscopía de fluorescencia o instrumentos confocales láser 1,2. Esas estrategias pueden reflejar bien la colonización bacteriana in situ3, pero no son tan precisas como los métodos tradicionales de recuento en placa en la cuantificación. Además, debido a la limitación de mostrar solo zonas radiculares parciales bajo el microscopio, a veces puede estar influenciado por un sesgo subjetivo.
Aquí, describimos un método cuantitativo, que incluye la recolección de las células bacterianas colonizadas y el recuento de las UFC bacterianas en una placa. Este método se basa en la dilución y el recubrimiento mediante el cual se pueden contar las cepas colonizadas que se eliminaron de las raíces de las plantas, y se puede calcular el número total de bacterias colonizadas en la raíz 4,5.
Primero, A. thaliana se cultivó en condiciones hidropónicas, y luego se inocularon células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de 0.01 OD600. Los tejidos radiculares infectados se recolectaron 2 días después de la inoculación y se lavaron con agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. Además, se recolectaron células bacterianas colonizadas en la raíz, se diluyeron en tampón salino tamponado con fosfato (PBS) y se colocaron en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Después de la incubación a 37 °C durante 10 h, se contaron y normalizaron colonias individuales en placas LB para determinar las células bacterianas colonizadas en las raíces.
Este método es altamente aplicable, tiene buena repetibilidad y es más adecuado para la determinación precisa de la colonización bacteriana de la rizosfera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

La medición de la colonización bacteriana en la raíz de Arabidopsis thaliana es uno de los experimentos más frecuentes en los estudios de interacción planta-microbio. Es necesario un método estandarizado para medir la colonización bacteriana en la rizosfera para mejorar la reproducibilidad. Primero cultivamos A. thaliana estéril en condiciones hidropónicas y luego inoculamos las células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de OD600 de 0,01. A los 2 días después de la inoculación, el tejido de la raíz se cosechó y se lavó tres veces en agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. A continuación, se pesaron las raíces y se recogieron por vórtice las células bacterianas colonizadas en la raíz. La suspensión celular se diluyó en un gradiente con un tampón salino tamponado con fosfato (PBS), seguido de un recubrimiento en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Las placas se incubaron a 37 °C durante 10 h y, a continuación, se contaron y normalizaron las colonias individuales en placas LB para indicar las células bacterianas colonizadas en las raíces. Este método se utiliza para detectar la colonización bacteriana en la rizosfera en condiciones de mono-interacción, con buena reproducibilidad.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Autor destacado: Mejora de la colonización de rizobacterias en las raíces de las plantas para mejorar la eficiencia de los fertilizantes microbianos

Medición de la colonización bacteriana en raíces de Arabidopsis thaliana en condiciones hidropónicas

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

Para probar la precisión de la capacidad de colonización de bacterias detectada por este método en la rizosfera de A. thaliana, inoculamos Bacillus velezensis SQR9 WT y un mutante derivado Δ8mcp en la rizosfera de A. thaliana por separado. El Δ8mcp es un mutante que carece de todos los genes que codifican para quimiorreceptores, y tiene una colonización significativamente disminuida6. Se midió su colonización a los 2 días después de la inocula...

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La colonización de las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) en la rizosfera es esencial para su efecto promotor del crecimiento. Es necesario estandarizar el método de detección de la colonización bacteriana de la rizosfera. Aquí, describimos un método reproducible para cuantificar la colonización bacteriana en la superficie de la raíz.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Nuestra investigación se centra en la interacción de las rizobacterias beneficiosas con las raíces de las plantas. Buscamos los mecanismos clave para potenciar la colonización de bacterias beneficiosas, mejorando así la eficiencia y la estabilidad de los fertilizantes microbianos en el campo. Los métodos para la colonización bacteriana de las raíces de las plantas se han estudiado ampliamente, pero todavía existen problemas.Por ejemplo, es difícil medir la colonización en diferentes sitios de manera distintiva, en el futuro creemos que la aplicación del microscopio y el conteo de alto rendimiento ayudarán a resolver los problemas. Nuestro protocolo es altamente aplicable con buena repetibilidad, y es más adecuado para la determinación precisa de la colonización de bacterias de la rizosfera.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

446 vistas.  Chinese Academy of Agricultural Sciences. Nuestra investigación se centra en la interacción de las rizobacterias beneficiosas con las raíces de las plantas. Buscamos los mecanismos clave para potenciar la colonización de bacterias beneficiosas, mejorando así la eficiencia y la estabilidad de los fertilizantes microbianos en el campo. Los métodos para la colonización bacteriana de las raíces de las plantas se han estudiado ampliamente, pero todavía existen problemas.Por ejemplo, es difícil medir la colonización en di...

Video: Autor destacado: Mejora de la colonización de rizobacterias en las raíces de las plantas para mejorar la eficiencia de los fertilizantes microbianos

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.