La fusión de membranas media muchas funciones biológicas. Este protocolo describe un método para detectar la apertura de los poros de fusión y la dinámica de liberación del transmisor y distinguir tres modos de fusión: fusión cerrada, fusión de permanencia y fusión de contracción. La combinación del microscopio confocal y el registro de la pinza de parche facilita la visualización de la apertura y el cierre de los poros de fusión y la determinación de su cinética.
Aunque se describe para las células cromafines, el principio del método descrito aquí se puede aplicar ampliamente a muchas células secretoras mucho más allá de las células cromafines. La implementación exitosa de este método depende de varios pasos generales, como la generación de un cultivo celular primario de cromafines saludable, una eficiencia de transfección de plásmidos suficiente y una alta tasa de éxito de registro electrofisiológico. Elija tres glándulas intactas sin cortes ni hemorragias en la superficie y elimine el tejido graso con tijeras.
Lave las glándulas por perfusión con la solución de Locke hasta que no salga sangre. Para la digestión, inyecte la solución enzimática a través de la vena suprarrenal con una jeringa de 30 milímetros conectada con un filtro de 0,22 micrómetros hasta que la glándula comience a hincharse. Luego deje las glándulas a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Inyecte de nuevo y deje las glándulas a 37 grados centígrados durante otros 10 minutos. Después de la digestión, corte la glándula longitudinalmente desde la vena suprarrenal hasta el otro extremo con tijeras para desplegar la glándula. Aísle la médula blanca tirándola en trozos en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga la solución de Locke.
Cortar y picar la médula con tijeras. Filtre la suspensión de la médula con una malla de nylon de 80 a 100 micrómetros en un vaso de precipitados. Transfiera el filtrado a un tubo cónico de 50 mililitros y centrífuga a temperatura ambiente de 48 x g durante tres minutos con una desaceleración de tres.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la celda con la solución de Locke mediante pipeteo. Filtre la suspensión celular con un colador de 80 a 100 micrómetros y centrífuga a temperatura ambiente de 48 x g durante tres minutos con desaceleración tres. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 30 mililitros de medio de cultivo.
Determine el número de células utilizando una cámara de conteo de hemocitómetros. Transfiera 2, 800, 000 células a un tubo de 15 mililitros. Pellet las células por centrifugación a 48 x g durante dos minutos con la desaceleración de tres.
Agregue 100 microlitros de tampón de transección proporcionado por el fabricante al pellet celular. Y luego agregue dos microgramos de plásmido PH-mNG. Mezcle suavemente la suspensión canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo y transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación sin demora.
Transfiera inmediatamente la cubeta al electroporador, seleccione el programa 005 en la lista de pantallas y presione Entrar para realizar la electroporación. Después de la electroporación, agregue inmediatamente 1,8 mililitros de medio a la cubeta y mezcle suavemente con una micropipeta equipada con una punta estéril. Agregue 300 microlitros de la suspensión de las celdas electroporadas en el resbalón de la cubierta en cada plato, de cinco a seis platos en total para una reacción de electroporación.
Transfiera cuidadosamente los platos a una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 9% de dióxido de carbono durante 30 minutos y agregue suavemente dos mililitros de medio precalentado a cada plato después de 30 minutos. Prepare pipetas de parche a partir de capilares de vidrio de borosilicato tirando de ellas con un extractor de pipetas, cubriendo sus puntas con cera líquida y puliéndolas con una microtorcha. Encienda el amplificador de grabación de la abrazadera de parche e inicie el software.
Establezca los parámetros de registro de capacitancia y corriente de calcio apropiados del software. Establezca un protocolo de grabación de 60 segundos de duración en total donde la estimulación comienza a los 10 segundos. Ajuste el potencial de retención para la grabación de la abrazadera de voltaje a 80 milivoltios.
Establezca una despolarización de un segundo de menos 80 milivoltios a 10 milivoltios como estímulo para inducir la afluencia de calcio y el salto de capacitancia. Encienda el sistema de microscopio confocal y establezca los parámetros apropiados en el software. Encienda los láseres, incluidos 458 nanómetros, 514 nanómetros y 633 nanómetros, y establezca el rango de recolección de emisiones para cada láser de acuerdo con cada sonda de fluorescencia.
Elija un plato con buen estado celular y expresión adecuada y agregue dos microlitros de neurotransmisor falso de fluorescencia FFN511 en el medio en el plato. Vuelva a poner el plato en la incubadora durante 20 minutos. Después de cargar FFN511, prepare la cámara de grabación y agregue dos microlitros de colorante de fluorescencia A655 en 50 microlitros de solución de baño.
Transfiera el resbalón de la cubierta del plato a la cámara de grabación con pinzas e inmediatamente agregue la solución de baño que contiene A655. Coloque una gota de aceite en el objetivo de inmersión de aceite 100X. Monte la cámara en el microscopio y use la perilla de ajuste para hacer que el aceite entre en contacto con la parte inferior del deslizamiento de la cubierta.
Enfoque las células y utilice imágenes de campo brillante y confocales para encontrar una célula adecuada con expresión de mNG. Amplíe la celda seleccionada y centréela en el campo de visión, minimizando las regiones en blanco. Establezca parámetros para imágenes confocales de plano XY en un plano Z fijo de FFN511, PH-mNG y A665 con un intervalo de tiempo minimizado.
Ajuste el enfoque a la parte inferior de la celda con una perilla de ajuste fino. Ajuste la potencia del láser de excitación en el software para encontrar una configuración para obtener la mejor relación señal-ruido y evitar un blanqueamiento significativo de la fluorescencia. Agregue nueve microlitros de solución interna en una pipeta de parche y conecte la pipeta al soporte de la etapa del amplificador de abrazadera de parche.
Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con una jeringa y mueva la punta de la pipeta para tocar la solución de baño con un micromanipulador. Asegúrese de que el amplificador muestre que la resistencia de la pipeta es aproximadamente entre dos y cuatro megaohmios con una prueba de pulso de voltaje. Pulse LJ/Auto para cancelar la unión líquida.
Mueva la pipeta hacia la celda seleccionada con un micromanipulador. Para formar un modo de conexión de celda, mueva la punta de la pipeta para tocar la celda. Cambie el potencial de retención de cero a menos 80 milivoltios mientras aplica una presión negativa suave con una jeringa.
Una vez que la resistencia pase un gigaohmio, espere aproximadamente 30 segundos para que la configuración se estabilice. Presione C-fast/Auto para compensar la capacitancia rápida. Para formar un modo mayorista, aplique pulsos cortos pero potentes de presión negativa con la jeringa hasta que la membrana se rompa.
Presione C-slow/Auto para compensar la capacitancia lenta. Ajuste ligeramente el enfoque de la imagen para enfocar la parte inferior de la célula. Inicie la grabación simultánea de imágenes de lapso de tiempo confocal y de la abrazadera de parche haciendo clic en los botones Inicio con dos aplicaciones de software diferentes.
Después de grabar, asegúrese de que los datos se guarden. Cambie el potencial de retención a cero milivoltios. Retire la pipeta de la solución de baño y deséchela.
Abra los archivos de imágenes sin procesar con cualquier fabricante o software suministrado. Vaya a Procesar, haga clic en ProcessTools y use las herramientas para generar archivos promedio continuos para cada imagen de lapso de tiempo. Guarde estos archivos.
En cuantificar, vaya a Herramientas y haga clic en los botones Perfil de pila para verificar los puntos de tiempo antes y después de la estimulación e identificar los cambios de fluorescencia en cada canal. Haga clic en el botón Dibujar elipse para rodear las regiones de interés para los eventos de fusión. Haga clic derecho en la imagen y haga clic en Guardar ROI para guardar.
Haga clic en Abrir proyectos para buscar el archivo sin procesar. Haga clic con el botón derecho en la imagen y haga clic en Cargar ROI para cargar el archivo ROI en el archivo de imágenes sin procesar para medir las intensidades de fluorescencia. Vaya a Herramientas y haga clic en Ordenar ROI en el software y trace los rastros para los tres canales de cada ROI.
Haga clic en Informe para guardar los datos de ROI, incluidos los datos digitales y los rastros de imágenes para cada ROI en una carpeta de archivos. Se realizó el registro de la pinza de parche de toda la célula y la aplicación de una despolarización de un segundo de 80 a 10 milivoltios para evocar exo y endocitosis. La despolarización aplicada indujo una corriente de calcio hacia adentro, un salto de capacitancia, que indica exocitosis, y una desintegración de capacitancia después del salto, lo que indica endocitosis.
Con imágenes de lapso de tiempo en el fondo de la célula, los eventos de fusión inducidos por el protocolo de despolarización de un segundo se indicaron como disminución de FFN que refleja la liberación de FFN511, acompañada de aumento de fluorescencia puntual de FPH y A655, reflejando la difusión de PH-mNG y A655 desde la membrana plasmática y la solución de baño en la vesícula fusionada. La figura presenta una fusión cercana identificada como atenuación F655, mientras que FPH sostenida o decaída con un retraso. La figura representa la fusión de estancia detectada por la presencia de manchas PH-mNG y A655.
La figura representa la fusión retráctil detectada como desintegración paralela de FPH y F655 acompañada de una reducción de tamaño paralela del punto PH-mNG y el punto A655 El registro exitoso requiere generar toda la configuración de la célula con patch-clamp e imágenes en la parte inferior de la célula con la intensidad fluorescente adecuada para cada canal. La combinación de electrofisiología y microscopía de superresolución descrita aquí es una herramienta valiosa para medir la dinámica de los poros de fusión y los neurocircuitos.
