Este método describe una técnica para estudiar la remodelación de la membrana durante la migración de neutrófilos en el animal vivo utilizando microscopía subcelular intravital. Este protocolo proporciona un enfoque único para estudiar la dinámica de la membrana durante la migración animal en condiciones físicas, y para desinvolucrar el microambiente tisular. Esta técnica se puede adaptar para abordar la remodelación de la membrana y el reposicionamiento dinámico de los órganos del citoesqueleto y el tráfico de membranas en diferentes tipos de células y células migratorias.
Para empezar, añade el tinte verde fluorescente a la suspensión de neutrófilos, purificada del ratón salvaje en 1,5 mililitros de tubo recubierto de BSA. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo una agitación suave en un rotor de tubo. Administre tres lavados con HBSS, seguidos de una centrifugación a 400 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos y vuelva a suspender el pellet en una solución salina equilibrada de Hanks de un mililitro.
Coloque esta suspensión en el tubo recubierto de BSA en un rotor de tubo bajo agitación suave hasta el procedimiento de inyección. Antes de la inyección, vuelva a suspender el gránulo celular en solución salina para alcanzar una densidad de 2 millones a 5 millones de células por 20 microlitros. Transfiera al animal anestesiado a una almohadilla térmica a 37 grados centígrados para mantener su temperatura corporal.
Después de probar el reflejo de retirada de la pata, retire los pelos de la oreja con un recortador fino para optimizar la calidad de la imagen. Coloque al animal de lado, sostenga el borde de la oreja y aplánelo a lo largo de la almohadilla térmica con la cinta quirúrgica, luego llene una jeringa equipada con una aguja de calibre 33 con la suspensión de neutrófilos y móntela en un micromanipulador. Mueva suavemente la aguja hacia la oreja y perfore lentamente la piel.
Una vez que la aguja esté dentro de la piel, empuje lentamente el pistón y entregue de dos a tres microlitros de suspensión celular. Después de repetir cuidadosamente la inyección en dos o tres áreas diferentes de la oreja, retire con cuidado la cinta quirúrgica y deje que el animal recupere la conciencia bajo supervisión. Deje que el animal descanse durante una hora antes de obtener imágenes para que el tejido y las células se recuperen del procedimiento de inyección.
Asegúrese de que el microscopio esté encendido y que la platina y las lentes estén precalentadas a 37 grados centígrados antes de colocar al animal anestesiado en la platina del microscopio. Cubre el agujero en el escenario con un cubreobjetos de vidrio. Mueva al animal anestesiado al escenario con cuidado.
Si se planea tomar imágenes durante más de una hora, aplique el ungüento oftálmico y asegure el sistema de perfusión basado en infusión alada. Coloque una gota de solución salina en el centro del cubreobjetos y coloque la oreja inyectada por neutrófilos encima de ella. Aplana suavemente la oreja con un bastoncillo de algodón estéril en el centro del cubreobjetos para eliminar las bolsas de aire.
Asegure la oreja presionando suavemente un palo de madera a un lado de la oreja más cerca de la cabeza del animal y bloqueándola con cinta adhesiva. A continuación, encuentre un área de interés con el ocular del microscopio y cambie al modo de adquisición de múltiples fotones. Ajuste la longitud de onda de excitación del láser a 900 a 930 nanómetros para permitir la adquisición simultánea de tinte verde fluorescente, mTomato y colágeno-I.
A continuación, configure el conjunto adecuado de espejos y combinaciones de filtros en los detectores para recoger la luz emitida. Determine la configuración más adecuada para la configuración de hardware. Incluso si las células migratorias se pueden rastrear con intervalos de 30 segundos a un minuto, las imágenes de eventos subcelulares con una velocidad más alta de al menos menos diez segundos en intervalos.
En el enfoque clásico de microscopía intravital, utilice una lente de 30X y un escáner Galvo con un tamaño de imagen de 512 por 512 píxeles para rastrear la migración celular e investigar el tejido del ratón huésped, y establezca el desplazamiento del eje Z utilizando la etapa motorizada con un tamaño de paso de dos micrómetros para permitir la obtención de imágenes de un volumen de 30 micrómetros de profundidad cada 30 segundos. En el enfoque de microscopía subcelular intravital, utilice una lente de 40X y un escáner de resonancia con un promedio de tres veces para obtener imágenes de la remodelación altamente dinámica de la membrana con un aumento y una resolución más altos. También configure el desplazamiento del eje Z utilizando un piezoeléctrico con un tamaño de paso de un micrómetro, lo que permite obtener imágenes de volumen de 20 micrómetros de profundidad cada cuatro o cinco segundos.
Induzca una lesión láser estéril para desencadenar la migración de neutrófilos enfocando un láser de excitación de alta potencia en un área estrecha de 20 por 20 micrómetros durante 10 segundos. Identificar las lesiones inducidas por el láser por sus fuertes señales autofluorescentes que aparecen en todos los canales, y por la consiguiente alteración de la disposición del colágeno. Guarde los datos al final de la experimentación para análisis posteriores.
El ratón receptor permitió visualizar las características estructurales del tejido del oído, como los vasos sanguíneos, las células residentes y los folículos pilosos, a través de un enfoque basado en la microscopía intravital. Las lesiones inducidas por láser fueron fácilmente visualizadas debido a su fuerte autofluorescencia detectada en todos los canales, y por las alteraciones de la disposición del colágeno. Una vista completa de la arquitectura tridimensional de la piel y la localización de los neutrófilos inyectados retrata una pila Z de la piel desde las capas externas a internas EN una representación de volumen tridimensional.
Las imágenes de lapso de tiempo mostraron a los neutrófilos tomando muestras de la piel del oído e interactuando con la matriz intracelular y el tejido del huésped. Utilizando la microscopía subcelular intravital, se visualiza claramente la remodelación dinámica de la membrana plasmática durante la migración, la formación de protuberancias de la membrana en el borde delantero y la retracción de la parte posterior de las células. Las secuencias time-lapse revelan la complejidad de las interacciones con la matriz intracelular.
La dinámica local de la membrana plasmática se analizó utilizando un algoritmo basado en la identificación de 100 puntos límite subyacentes a la superficie celular. Los cambios en la curvatura local y el área subrayada por las protuberancias de la membrana plasmática se calcularon para cada punto límite y se informaron para cada período de tiempo como quimógrafos. Tanto la parte delantera como la trasera de las células mantienen una curvatura más alta que el lateral de las células.
Los cambios de área negativos son más evidentes en la parte posterior de las celdas que en el borde de ataque, donde los cambios de área positivos son más prominentes. Después de la toma de imágenes, se puede recolectar, fijar y procesar tejido para teñirlo con el fin de evaluar más a fondo el objetivo de interés y dilucidar los mecanismos. Este procedimiento, diseñado para obtener imágenes de la dinámica de la membrana, se puede adaptar para abordar cuestiones más amplias de biología celular en diferentes tipos de células y células en migración en sus respectivos entornos.
