Estamos introduciendo un método para establecer el cultivo organoide del epitelio de la vía aérea humana en placas de cultivo. Derivamos organoides pulmonares humanos directamente de tejidos pulmonares primarios con alta eficiencia. Los organoides pulmonares humanos derivados se expanden de manera estable durante más de un año, y un protocolo de diferenciación proximal permite la generación de organoides maduros de las vías respiratorias que pueden simular fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico.
Por lo tanto, el sistema de cultivo permite a los científicos reconstruir y expandir el epitelio de las vías respiratorias humanas en placas de cultivo. Demostrando el procedimiento estarán Man Chun Chiu y Yifei Yu, estudiantes de doctorado en nuestro laboratorio Para comenzar el aislamiento celular de los tejidos pulmonares humanos para el cultivo de organoides en 3D, picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños de un milímetro con un bisturí estéril y lavar los trozos de tejido con 10 mililitros de medio basal frío. Centrifugar los tejidos a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante antes de volver a depositar el pellet en ocho mililitros de medio basal suplementado con colagenasa a una concentración final de dos miligramos por mililitro.
Luego, digiera las piezas de tejido agitando el tubo a 120 RPM durante 30 a 40 minutos a 37 grados centígrados. Después de la digestión, binote hacia arriba y hacia abajo 20 veces usando una pipeta serológica de 10 mililitros para cortar las piezas de tejido digeridas. Luego, filtre la suspensión con un colador de 100 micras en un tubo de 50 mililitros.
Recupere y transfiera las piezas de tejido del colador a un tubo centrífugo de 15 mililitros con el medio basal. Para terminar la digestión, agregue suero bovino fetal al flujo a través de una concentración final del 2% Luego, centrifugue el tubo y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros del medio basal como se describió anteriormente. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 80 a 160 microlitros de medio de matriz de sótano frío y coloque los tubos sobre hielo.
A continuación, dispense 40 microlitros de la suspensión a cada pozo de una placa de cultivo de suspensión de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Permita que la matriz del sótano se solidifique y forme una gota.
Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de expansión de organoides pulmonares humanos suplementados con cinco nanomolares de heregulina beta 1 a cada pozo e incube la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de tres días, retire el medio viejo mientras mantiene la gota intacta y agregue cuidadosamente el medio fresco. Después de 10 a 14 días de pase, observe los organoides bajo un microscopio y asegúrese de que los organoides no estén incrustados con una densidad celular muy alta.
Para pasar los organoides pulmonares con cizallamiento, rompa las gotas mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una punta de un mililitro. Luego, transfiera los organoides junto con el medio a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y ajuste el volumen a 10 mililitros con un medio basal frío. Centrifugar el tubo a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, desechar el sobrenadante y lavar los organoides con 10 mililitros de medio basal frío.
Luego, resuspende los organoides en dos mililitros de medio basal frío y cizalla en trozos pequeños con una pipeta Pasteur. A continuación, agregue el medio basal a un volumen total de 10 mililitros y centrífuga antes de volver a depositar los fragmentos organoides con una matriz de basamento frío suficiente para permitir una expansión de 1: 3 a 1: 5 y coloque los tubos en hielo. Dispense 40 microlitros de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada para incubar a 37 grados Celsius para permitir que la matriz del sótano se solidifique durante 10 a 15 minutos.
Más tarde, agregue 500 microlitros de medio de expansión organoide pulmonar a cada pozo e incube en una incubadora de cultivo celular. Refrescar el medio cada tres días y pasar los organoides cada dos semanas. Para pasar organoides pulmonares con tripsinización, resuspend extrajo organoides pulmonares en un mililitro de enzima de disociación.
Incubar el organoide en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. Luego, agregue un mililitro de medio basal al tubo y corte los organoides mecánicamente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Verifique el tamaño de las piezas organoides bajo un microscopio a un aumento de 100X antes de terminar la digestión con 40 microlitros de suero fetal bovino.
Enrasar el volumen hasta 10 mililitros con medio basal y centrífuga antes de volver a depositar las piezas organoides en una matriz de basamento frío con un volumen suficiente para pasar con una proporción de 1:5 a 1:10. Más tarde, dispensar 40 microlitros de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cultivar la placa como se demostró anteriormente. Para generar organoides 3D de las vías respiratorias, incube los organoides pulmonares en el medio de expansión durante siete a 10 días después del paso a través de la cizalladura mecánica.
Luego, reemplace el medio de expansión con el medio de diferenciación proximal e incube los organoides en una incubadora de cultivo celular. Después de 14 días, deseche el medio en cada pocillo y agregue tampón de lisado celular para cosechar el organoide diferenciado de las vías respiratorias para la extracción de ARN y la detección de la expresión génica celular mediante el ensayo RT-qPCR. Preincuba los insertos en la incubadora de cultivo celular con 250 y 500 microlitros del medio basal en la cámara superior e inferior de una placa de 24 pocillos, respectivamente.
Luego, agregue un mililitro de medio basal al tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en células individuales. Observe las células bajo un microscopio antes de terminar la digestión con 40 microlitros de suero fetal bovino. Filtre las células a través de un colador de 40 micras en un tubo de 50 mililitros y transfiera la suspensión de células filtradas a un tubo de 15 mililitros.
Recarga la suspensión con medio basal hasta un volumen total de 10 mililitros. Después de la centrifugación, resuspender el pellet recogido de 24 gotas en 1 a 2,5 mililitros de medio de expansión organoide pulmonar, dependiendo de la densidad celular. Cuente el número de células con el contador celular bajo un microscopio, luego ajuste la concentración celular a 1.3 veces 10 a seis por mililitro para insertos de 24 pocillos.
Retire el medio basal de las cámaras superior e inferior antes de agregar 500 microlitros de medio de expansión en la cámara inferior. Separe 100 microlitros de suspensión celular preparados anteriormente en la cámara apical del inserto de 24 pocillos e incuben. Después de dos días, reemplace el medio de expansión con un medio de diferenciación proximal tanto en la cámara apical como en la inferior de la placa.
Incubar los organoides durante 14 días y refrescar el medio cada tres días. Mida la resistencia eléctrica transepitelial todos los días utilizando un sistema de medición de resistencia eléctrica. En la microfotografía representativa, las células pulmonares recién aisladas se pueden ver incrustadas en la matriz de membrana basal del factor de crecimiento reducido tipo dos.
Los organoides quísticos fueron apareciendo y creciendo con el tiempo. Los organoides pulmonares después del cuarto pasaje se muestran aquí. A las dos horas de la cizalladura mecánica, los fragmentos organoides incrustados en el extracto de la membrana basal formaron los dominios quísticos.
La microfotografía del mismo campo en el quinto día confirmó el crecimiento de organoides a lo largo del tiempo. Los organoides en expansión albergaban los cuatro tipos principales de células epiteliales de las vías respiratorias, incluidas las células ciliadas positivas para ACCTUB o FOXJ1 positivas, las células basales P63 positivas, las células club CC10 positivas y las células caliciformes positivas para MUC5AC en un estado prematuro. Los organoides incubados en el medio de expansión y diferenciación proximal desarrollaron una morfología distinta a lo largo del tiempo.
Después de dos semanas de diferenciación en el medio de diferenciación proximal, los cilios móviles fueron discernibles en cada organoide. Se observó que la celia que golpeaba sincrónicamente conducía los desechos celulares dentro de la luz organoide y los arremolinaba unidireccionalmente para eliminar las partículas inhaladas. Además, el análisis de citometría de flujo demostró que los organoides diferenciados acomodaron cuatro tipos de células epiteliales de las vías respiratorias en el medio de diferenciación y expansión proximal.
Después de dos semanas de diferenciación, los organoides de las vías respiratorias 2D desarrollaron una barrera epitelial intacta. Se realizó un ensayo de bloqueo de dextrano para evaluar la integridad de la barrera epitelial formada en organoides de las vías respiratorias 2D. Los organoides 2D contenían abundantes células ciliadas.
El organoide pulmonar expandible a largo plazo y el organoide diferenciado de las vías respiratorias proporcionan un sistema modelo fisiológicamente activo y universal para estudiar la biología y la patología respiratorias, incluida la COVID-19.
