ヒト気道上皮のオルガノイド培養を培養プレートに樹立する方法を導入している。ヒト肺オルガノイドは、一次肺組織から直接高効率で導出します。誘導されたヒト肺オルガノイドは1年以上にわたって安定に拡張され、近位分化プロトコルは、ヒト気道上皮をほぼ生理学的レベルまで忠実にシミュレートすることができる成熟気道オルガノイドの生成を可能にする。
したがって、培養システムは、科学者が培養プレート中のヒト気道上皮を再構築および拡張することを可能にする。手順を実証する Man Chun ChiuとYifei Yu、私たちの研究室の博士課程の学生です 3Dオルガノイド培養のためにヒト肺組織からの細胞単離を開始するには、滅菌メスで肺組織を1ミリメートルの小片に細かく刻み、10ミリリットルの冷たい基礎培地で組織片を洗う。組織を400倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨ててから、コラゲナーゼを1ミリリットルあたり2ミリグラムの最終濃度で添加した8ミリリットルの基礎培地にペレットを再懸濁させた。
次いで、チューブを摂氏37度で30〜40分間、120RPMで振盪することによって組織片を消化する。消化後、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いてピペットを上下に20回、消化した組織片を剪断した。次に、懸濁液を100ミクロンのストレーナーで50ミリリットルのチューブにろ過します。
組織片をストレーナーから回収し、基礎培地を含む15ミリリットルの遠沈管に移す。消化を終了するために、ウシ胎児血清を最終濃度2%までフロースルーに加え、次いで、チューブを遠心分離し、前述のように細胞ペレットを10ミリリットルの基礎培地に再懸濁する。遠心分離後、ペレットを80〜160マイクロリットルの冷たい地下室マトリックス培地に再懸濁し、チューブを氷上に置く。
次に、予め加温した24穴浮遊培養プレートの各ウェルに40マイクロリットルの懸濁液を分注する。プレートを摂氏37度で10〜15分間インキュベートする。地下室のマトリックスが固化し、液滴を形成するのを許します。
インキュベーション後、5ナノモルのヘレグリンβ1を添加した500マイクロリットルのヒト肺オルガノイド増殖培地を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。3日後、液滴をそのまま保ちながら古い培地を取り除き、新鮮な培地を慎重に加える。継代の10〜14日後、顕微鏡下でオルガノイドを観察し、オルガノイドが非常に高い細胞密度で埋め込まれていないことを確認する。
剪断で肺オルガノイドを通過させるには、1ミリリットルの先端で上下にピペッティングして液滴を切断する。次に、オルガノイドを培地とともに15ミリリットルの遠沈管に移し、冷たい基礎培地で体積を10ミリリットルに調整する。チューブを300倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨て、オルガノイドを10ミリリットルの冷たい基礎培地で洗浄する。
その後、オルガノイドを2ミリリットルの冷たい基礎培地に再懸濁し、パスツールピペットで小片に剪断する。次に、基礎培地を総容量10ミリリットルに加え、遠心分離機をかけてから、オルガノイド断片を1:3〜1:5の膨張を可能にするのに十分な冷たい地下室マトリックスで再懸濁し、チューブを氷の上に置きます。予め加温した24ウェルプレートの各ウェルに40マイクロリットルのオルガノイド懸濁液を分注し、摂氏37度でインキュベートして、地下室マトリックスを10〜15分間固化させる。
その後、各ウェルに500マイクロリットルの肺オルガノイド膨張培地を加え、細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。3日ごとに培地をリフレッシュし、2週間ごとにオルガノイドを継代する。トリプシン処理で肺オルガノイドを通過させるために、採取した肺オルガノイドを1ミリリットルの解離酵素で再懸濁する。
オルガノイドを摂氏37度の水浴中で3〜5分間孵化させる。次に、1ミリリットルの基礎培地をチューブに加え、上下にピペッティングしてオルガノイドを機械的に剪断する。40マイクロリットルのウシ胎児血清で消化を終了する前に、100倍の倍率で顕微鏡下でオルガノイド片のサイズを確認してください。
1:5〜1:10の比率で通過するのに十分な体積を有する冷たい地下室マトリックスにオルガノイド片を再懸濁する前に、基礎培地および遠心分離機で体積を10ミリリットルにする。その後、24ウェルプレートの各ウェルに40マイクロリットルのオルガノイド懸濁液を分注し、前に実証したようにプレートを培養する。3D気道オルガノイドを生成するには、機械的剪断を介して継代後7〜10日間、肺オルガノイドを膨張培地中でインキュベートする。
次いで、膨張培地を近位分化培地と交換し、細胞培養インキュベーター内でオルガノイドをインキュベートする。14日後、各ウェル内の培地を捨て、細胞破砕液緩衝液を加えて、RNA抽出およびRT-qPCRアッセイによる細胞遺伝子発現の検出のために分化気道オルガノイドを回収した。細胞培養インキュベーター内のインサートを、それぞれ24ウェルプレートの上部および下部チャンバー内の250および500マイクロリットルの基礎培地と共にプレインキュベートする。
次に、1ミリリットルの基礎培地をチューブに加え、ピペットを上下にしてオルガノイドを単一細胞に剪断する。40マイクロリットルのウシ胎児血清で消化を終了する前に、顕微鏡下で細胞を観察してください。細胞を40ミクロンのストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに濾過し、濾過した細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移す。
懸濁液を基礎培地で10ミリリットルの総容量まで補充する。遠心分離後、細胞密度に応じて、24滴から回収したペレットを1〜2.5ミリリットルの肺オルガノイド膨張培地に再懸濁する。顕微鏡下で細胞カウンターで細胞数をカウントし、細胞濃度を24ウェルインサートの場合、1ミリリットルあたり6倍に対して10倍から1.3倍に調整します。
上部チャンバと下部チャンバから基礎培地を取り出してから、下部チャンバに500マイクロリットルの膨張培地を追加します。先に調製した細胞懸濁液100マイクロリットルの種子を24ウェルインサートの頂端チャンバー上にインキュベートした。2日後、プレートの頂端および底部チャンバの両方で拡張培地を近位分化培地と交換する。
オルガノイドを14日間インキュベートし、3日ごとに培地をリフレッシュする。電気抵抗測定システムを用いて毎日上皮経管電気抵抗を測定する。代表的な顕微鏡写真では、新たに単離された肺細胞が、還元された成長因子基底膜マトリックス2型に埋め込まれているのが分かる。
嚢胞性オルガノイドが出現し、時間の経過とともに成長した。第4継代後の肺オルガノイドがここで実証される。機械的剪断から2時間以内に、基底膜抽出物に埋め込まれたオルガノイド断片は嚢胞性ドメインを形成した。
5日目の同じフィールドの顕微鏡写真は、経時的なオルガノイド増殖を確認した。拡張オルガノイドは、ACCTUB陽性またはFOXJ1陽性繊毛細胞、P63陽性基底細胞、CC10陽性クラブ細胞、および早期状態のMUC5AC陽性杯細胞を含む4つの主要な気道上皮細胞タイプをすべて保有していた。拡張および近位分化培地中でインキュベートされたオルガノイドは、時間の経過とともに明確な形態を発達させた。
近位分化培地での分化の2週間後、運動性繊毛はすべてのオルガノイドにおいて識別可能であった。同期的に鼓動するセリアがオルガノイド内腔内の細胞破片を駆動し、それらを一方向に渦巻いて吸入粒子を除去することが観察された。さらに、フローサイトメトリー分析は、分化したオルガノイドが近位分化および拡張培地中に4つの気道上皮細胞型を収容することを実証した。
分化の2週間後、2D気道オルガノイドは無傷の上皮障壁を発達させた。2D気道オルガノイドにおいて形成された上皮障壁の完全性を評価するために、デキストラン遮断アッセイを実施した。2Dオルガノイドは豊富な繊毛細胞を含んでいた。
長期拡張可能な肺オルガノイドおよび分化気道オルガノイドは、COVID-19を含む呼吸器生物学および病理学を研究するための生理学的に活性で普遍的なモデルシステムを提供する。
