우리는 배양 접시에서 인간 기도 상피의 오가노이드 배양을 확립하는 방법을 소개하고 있습니다. 우리는 높은 효율로 원발성 폐 조직에서 직접 인간의 폐 오가노이드를 파생시킵니다. 유래된 인간 폐 오가노이드는 일 년 이상 안정적으로 확장되며, 근위 분화 프로토콜은 인간 기도 상피를 거의 생리학적 수준으로 충실하게 시뮬레이션할 수 있는 성숙한 기도 오가노이드의 생성을 허용한다.
따라서 배양 시스템은 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Man Chun Chiu와 Yifei Yu, PhD 학생들이 3D 오가노이드 배양을위한 인간 폐 조직으로부터 세포 분리를 시작하려면 폐 조직을 멸균 메스로 1 밀리미터 작은 조각으로 다듬고 차가운 기저 배지 10 밀리리터로 조직 조각을 씻으십시오. 조직을 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 G에서 원심분리하고, 콜라게나제가 보충된 8밀리리터의 기초 배지에 펠렛을 밀리리터당 두 밀리그램의 최종 농도로 재현탁시키기 전에 상층액을 버린다.
이어서, 섭씨 37도에서 30 내지 40분 동안 120 RPM에서 튜브를 흔들어 조직 조각을 소화시킨다. 소화 후, 10 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 20 번 위아래로 피펫을 사용하여 소화 된 조직 조각을 전단합니다. 그런 다음 현탁액을 100미크론 스트레이너로 50밀리리터 튜브로 여과합니다.
조직 조각을 회수하여 스트레이너로부터 기본 배지가 있는 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화를 종결시키기 위해, 유동관에 우태아 혈청을 2%의 최종 농도로 첨가한 다음, 튜브를 원심분리하고, 앞서 기술한 바와 같이 세포 펠릿을 10 밀리리터의 기초 배지에 재현탁시킨다. 원심분리 후, 펠렛을 80 내지 160 마이크로리터의 차가운 지하실 매트릭스 배지에 재현탁시키고 튜브를 얼음 위에 놓는다.
다음에, 40 마이크로리터의 현탁액을 미리 가온된 24-웰 현탁액 배양 플레이트의 각 웰에 분배한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 응고되어 물방울을 형성하도록하십시오.
배양 후, 500 마이크로리터의 헤레굴린-베타 1의 나노몰로 보충된 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 인큐베이션한다. 사흘 후, 물방울을 그대로 유지하면서 오래된 배지를 제거하고 조심스럽게 신선한 배지를 추가하십시오. 통과 후 10 ~ 14 일 후에 현미경으로 오가노이드를 관찰하고 오가노이드가 매우 높은 세포 밀도로 매립되지 않았는지 확인하십시오.
전단으로 폐 오가노이드를 통과하려면 한 밀리리터 팁으로 위아래로 피펫팅하여 물방울을 부러 뜨립니다. 그런 다음 배지와 함께 오가노이드를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 차가운 기저 배지로 부피를 10 밀리리터로 조정하십시오. 튜브를 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리하고, 상층액을 버리고, 10밀리리터의 차가운 기저 배지로 오가노이드를 세척한다.
그런 다음 오가노이드를 차가운 기저 배지 두 밀리리터에 재현탁하고 파스퇴르 피펫으로 작은 조각으로 전단하십시오. 다음으로, 1:3 내지 1:5 팽창을 가능하게 하기에 충분한 차가운 지하실 매트릭스로 오가노이드 단편을 재현탁하기 전에 10 밀리리터의 총 부피에 기초 배지를 첨가하고 튜브를 얼음 위에 놓는다. 미리 가온된 24웰 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 분배하여 섭씨 37도에서 인큐베이션하여 지하 매트릭스가 10 내지 15분 동안 응고되도록 한다.
나중에, 500 마이크로리터의 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 사흘마다 배지를 새로 고치고 두 주마다 오가노이드를 통과시킵니다. 트립신화로 폐 오가노이드를 통과시키려면 수확 된 폐 오가노이드를 해리 효소 한 밀리리터에 재현탁하십시오.
오르가노이드를 섭씨 37도 수조에서 3 ~ 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브에 한 밀리리터의 기본 배지를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 전단합니다. 40 마이크로 리터의 태아 소 혈청으로 소화를 종료하기 전에 100X 배율로 현미경으로 오가노이드 조각의 크기를 확인하십시오.
1:5 내지 1:10의 비율로 통과하기에 충분한 부피로 차가운 지하실 매트릭스에 오가노이드 조각을 재현탁하기 전에 기저 배지와 원심 분리기로 부피를 10 밀리리터까지 구성하십시오. 나중에, 40 마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 24-웰 플레이트의 각 웰에 분배하고, 이전에 입증된 바와 같이 플레이트를 배양한다. 3D 기도 오가노이드를 생성하려면, 기계적 전단을 통해 통과 후 7 내지 10일 동안 팽창 배지에서 폐 오가노이드를 인큐베이션한다.
이어서, 확장 배지를 근위 분화 배지로 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 오가노이드를 인큐베이션한다. 14일 후, 각 웰의 배지를 버리고 세포 용해물 완충액을 첨가하여 RNA 추출 및 RT-qPCR 분석법에 의한 세포 유전자 발현의 검출을 위해 분화된 기도 오가노이드를 수확한다. 예비-세포 배양 인큐베이터 내의 삽입물을 각각 24-웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버 내의 250 및 500 마이크로리터의 기저 배지와 함께 인큐베이션한다.
그런 다음 한 밀리리터의 기본 배지를 튜브에 넣고 피펫을 위아래로 피펫하여 오가노이드를 단일 세포로 전단하십시오. 40 마이크로 리터의 태아 소 혈청으로 소화를 종료하기 전에 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포를 40미크론 스트레이너를 통해 50밀리리터 튜브로 여과하고 여과된 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.
현탁액을 기본 매체로 보충하여 총 부피가 10 밀리리터입니다. 원심분리 후, 세포 밀도에 따라 1 내지 2.5 밀리리터의 폐 오가노이드 확장 배지에 24개의 액적으로부터 수집된 펠렛을 재현탁시킨다. 현미경으로 세포 계수기를 가진 세포의 수를 세고, 세포 농도를 24-웰 삽입물에 대해 밀리리터 당 10배에서 6배로 1.3배로 조정하십시오.
바닥 챔버에 500 마이크로리터의 팽창 배지를 첨가하기 전에 상부 및 하부 챔버로부터 기초 매질을 제거한다. 앞서 준비한 세포 현탁액 100 마이크로리터를 24-웰 인서트의 정점 챔버 상에 시드하고 인큐베이션한다. 이틀 후, 팽창 배지를 플레이트의 정점 및 바닥 챔버 모두에서 근위 분화 배지로 교체한다.
오가노이드를 14 일 동안 배양하고 사흘마다 배지를 새로 고칩니다. 전기 저항 측정 시스템을 사용하여 매일 상피 전기 저항을 측정하십시오. 대표적인 현미경 사진에서, 갓 분리된 폐 세포는 환원된 성장 인자 기저막 매트릭스 유형 두 형에 매립되어 있음을 알 수 있다.
낭포성 오가노이드가 나타나고 시간이 지남에 따라 성장했습니다. 네 번째 통로 이후의 폐 오가노이드가 여기에서 입증됩니다. 기계적 전단 후 두 시간 이내에, 기저막 추출물에 포매된 오가노이드 단편은 낭성 도메인을 형성하였다.
다섯 번째 날에 같은 필드의 현미경 사진은 시간에 따른 오가노이드 성장을 확인했다. 확장 오가노이드는 ACCTUB 양성 또는 FOXJ1 양성 섬모 세포, P63 양성 기저 세포, CC10 양성 클럽 세포 및 MUC5AC 양성 잔 세포를 포함한 네 가지 주요 기도 상피 세포 유형을 모두 조기 상태로 보유했다. 확장 및 근위 분화 배지에서 배양된 오가노이드는 시간이 지남에 따라 뚜렷한 형태학을 발전시켰다.
근위 분화 배지에서 분화 두 주 후, 모타일 섬모는 모든 오르가노이드에서 식별가능하였다. 동시적으로 박동하는 셀리아가 오가노이드 루멘 내부의 세포 파편을 몰고 흡입 된 입자를 제거하기 위해 일방향으로 소용돌이 치는 것이 관찰되었습니다. 또한, 유세포 분석 결과, 분화된 오가노이드가 근위 분화 및 확장 배지에서 네 가지 기도 상피 세포 유형을 수용한다는 것을 입증하였다.
분화 2 주 후, 2D 기도 오가노이드는 손상되지 않은 상피 장벽을 개발했습니다. 덱스트란 막힘 분석은 2D 기도 오가노이드에서 형성된 상피 장벽의 완전성을 평가하기 위해 수행되었다. 2D 오가노이드는 풍부한 섬모 세포를 함유했다.
장기간 확장 가능한 폐 오가노이드와 차별화된 기도 오가노이드는 COVID-19를 포함한 호흡기 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 생리활성 및 보편적인 모델 시스템을 제공합니다.
