Estamos introduzindo um método para estabelecer a cultura organoide do epitélio das vias aéreas humanas em placas de cultura. Derivamos organoide pulmonar humano diretamente de tecidos pulmonares primários com alta eficiência. O organoide pulmonar humano derivado é expandido por mais de um ano, e um protocolo de diferenciação proximal permite a geração de organoides maduros das vias aéreas que podem simular fielmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico.
Portanto, o sistema cultural permite que os cientistas reconstruam e expandam o epitélio das vias aéreas humanas em placas de cultura. Demonstrando o procedimento estarão Man Chun Chiu e Yifei Yu, estudantes de doutorado em nosso laboratório Para iniciar o isolamento celular dos tecidos pulmonares humanos para a cultura organoide 3D, pica os tecidos pulmonares em pequenos pedaços de um milímetro com um bisturi estéril e lave os pedaços de tecido com 10 mililitros de meio basal frio. Centrifugar os tecidos a 400 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenante antes de reutilizar a pelota em oito mililitros de meio basal suplementado com colagenase em uma concentração final de dois miligramas por mililitro.
Em seguida, digerir os pedaços de tecido sacudindo o tubo a 120 RPM por 30 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Após a digestão, pipeta para cima e para baixo 20 vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para tesourar os pedaços de tecido digerido. Em seguida, filtre a suspensão com um filtro de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros.
Recupere e transfira as peças de tecido do coador para um tubo de centrífuga de 15 mililitros com o meio basal. Para terminar a digestão, adicione o soro bovino fetal ao fluxo até uma concentração final de 2%Em seguida, centrifugar o tubo e resuspengar a pelota celular em 10 mililitros do meio basal como descrito anteriormente. Após a centrifugação, resuspenja a pelota em 80 a 160 microliters de matriz de porão frio média e coloque os tubos no gelo.
Em seguida, dispense 40 microliters da suspensão para cada poço de uma placa de cultura de suspensão pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Permita que a matriz do porão se solidifique e forme uma gota.
Após a incubação, adicione 500 microliters de organoides pulmonares humanos meio de expansão complementado com cinco nanomolar de heregulin-beta 1 para cada poço e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular. Após três dias, remova o meio antigo mantendo a gota intacta e adicione cuidadosamente o meio fresco. Após 10 a 14 dias de passagem, observe os organoides sob um microscópio e certifique-se de que os organoides não estejam incorporados com uma densidade celular muito alta.
Para passar os organoides pulmonares com cisalhamento, quebre as gotículas por pipetting para cima e para baixo com uma ponta de um mililitro. Em seguida, transfira os organoides junto com o tubo médio para um tubo centrífuga de 15 mililitros e ajuste o volume para 10 mililitros com um meio basal frio. Centrifugar o tubo a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, descartar o supernazio e lavar os organoides com 10 mililitros de meio basal frio.
Em seguida, resuspenque os organoides em dois mililitros de meio basal frio e corte em pequenos pedaços com uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione meio basal a um volume total de 10 mililitros e centrífuga antes de reutilizar os fragmentos organoides com uma matriz fria de porão suficiente para permitir uma expansão de 1:3 a 1:5 e colocar os tubos no gelo. Dispense 40 microliters de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços para incubar a 37 graus Celsius para permitir que a matriz do porão se solidifique por 10 a 15 minutos.
Posteriormente, adicione 500 microliters de meio de expansão organoide pulmonar a cada poço e incuba em uma incubadora de cultura celular. Refrescar o meio a cada três dias e passar os organoides a cada duas semanas. Para passagem de organoides pulmonares com trippsinização, resuspende colhiu organoides pulmonares colhidos em um mililitro de enzima dissociação.
Incubar o organoide em um banho de água de 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio basal ao tubo e enlouco que os organoides mecanicamente tubos para cima e para baixo. Verifique o tamanho das peças organoides sob um microscópio a 100X de ampliação antes de terminar a digestão com 40 microlitros de soro bovino fetal.
Coma o volume para 10 mililitros com meio basal e centrífuga antes de reutilizar as peças organoides em uma matriz fria de porão com volume suficiente para passagem com uma razão de 1:5 a 1:10. Mais tarde, dispense 40 microliters de suspensão organoide em cada poço de uma placa de 24 poços e cultua a placa como demonstrado anteriormente. Para gerar organoides das vias aéreas 3D, incubar os organoides pulmonares no meio de expansão por sete a 10 dias após a passagem via cisalhamento mecânico.
Em seguida, substitua o meio de expansão por meio de diferenciação proximal e incubar os organoides em uma incubadora de cultura celular. Após 14 dias, descarte o meio em cada poço e adicione tampão de lise celular para colher o organoide diferenciado das vias aéreas para extração de RNA e detecção de expressão genética celular pelo ensaio RT-qPCR. Pré-incubar as pastilhas na incubadora de cultura celular com 250 e 500 microliters do meio basal na câmara superior e inferior de uma placa de 24 poços, respectivamente.
Em seguida, adicione um mililitro de meio basal ao tubo e pipeta para cima e para baixo para transformar os organoides em células únicas. Observe as células sob um microscópio antes de terminar a digestão com 40 microlitros de soro bovino fetal. Filtre as células através de um filtro de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros e transfira a suspensão celular filtrada para um tubo de 15 mililitros.
Cubra a suspensão com meio basal a um volume total de 10 mililitros. Após a centrifugação, resuspengue a pelota coletada de 24 gotículas em 1 a 2,5 mililitros de meio de expansão organoide pulmonar, dependendo da densidade celular. Conte o número de células com o contador celular sob um microscópio, em seguida, ajuste a concentração celular para 1,3 vezes 10 para seis por mililitro para inserções de 24 poços.
Remova o meio basal das câmaras superior e inferior antes de adicionar 500 microliters de meio de expansão na câmara inferior. Sementes 100 microliters de suspensão celular preparados anteriormente na câmara apical da inserção e incubação de 24 poços. Após dois dias, substitua o meio de expansão por meio de diferenciação proximal tanto na câmara apical quanto inferior da placa.
Incubar os organoides por 14 dias e refrescar o meio a cada três dias. Meça a resistência elétrica trans-epitelial todos os dias usando um sistema de medição de resistência elétrica. Na microfotografia representativa, as células pulmonares recém-isoladas podem ser vistas embutidas na matriz de membrana de porão do fator de crescimento reduzido tipo dois.
Os organoides císticos apareceram e cresceram ao longo do tempo. Os organoides pulmonares após a quarta passagem são demonstrados aqui. Duas horas após a cisalhamento mecânico, os fragmentos organoides embutidos no extrato da membrana do porão formaram os domínios císticos.
A microfotografia do mesmo campo no quinto dia confirmou o crescimento organoide ao longo do tempo. Os organoides em expansão abrigaram todos os quatro principais tipos de células epiteliais das vias aéreas, incluindo célula ciliada positiva ou FOXJ1 positiva, célula basal P63 positiva, célula do clube CC10 positivo e célula de cálice positiva MUC5AC em um estado prematuro. Os organoides incubados no meio de expansão e diferenciação proximal desenvolveram morfologia distinta ao longo do tempo.
Após duas semanas de diferenciação no meio de diferenciação proximal, cílios motil eram perceptíveis em cada organoide. Observou-se que o espancamento sincronia celia levou os detritos celulares para dentro do lúmen organoide e rodou-os unidiretamente para remover as partículas inalações. Além disso, a análise da citometria de fluxo demonstrou que os organoides diferenciados acomodavam quatro tipos de células epiteliais das vias aéreas em meio de diferenciação e expansão proximal.
Após duas semanas de diferenciação, organoides das vias aéreas 2D desenvolveram uma barreira epitelial intacta. Foi realizado um ensaio de bloqueio do Dextran para avaliar a integridade da barreira epitelial formada em organoides das vias aéreas 2D. Os organoides 2D continham células ciliadas abundantes.
O organoide pulmonar expansível de longo prazo e o organoide diferenciado das vias aéreas fornecem um sistema modelo fisiologicamente ativo e universal para estudar biologia respiratória e patologia, incluindo o COVID-19.
