Una limitación importante de la microscopía de expansión es que la fluorescencia se ralentiza después de la polimerización y la digestión. La microscopía de expansión de retención de etiquetas, la llamamos LR-ExM, utiliza anclajes trifuncionales, que son para la polimerización y la digestión. Después de usar el anclaje de tres funciones, introducimos fluorescencia después del paso de expansión.
Por lo tanto, mantenemos una buena relación señal / ruido mientras tenemos una alta resolución. La microscopía de expansión de retención de etiquetas se puede combinar con cualquier otra microscopía de expansión introducida anteriormente, y también con microscopías fluorescentes. Es muy robusto en método versátil.
Y para imágenes de alta regulación, es realmente importante tener una señal mejorada. Para comenzar, cultive células en un vidrio de cubierta de cámara 16 bien extraíble con medio completo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Una vez que los recuentos celulares alcancen aproximadamente 40, 000, fije las células con 100 microlitros de PFA al 3.2% en tampón PEM durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego permeabilice las células con los 100 microlitros de tampón de permeablización a temperatura ambiente durante 15 minutos. Incubar las células con la solución de estreptavidina diluida en un tampón de bloqueo celular durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego enjuagar brevemente con 200 microlitros de tampón de bloqueo celular. A continuación, incube las células con 100 microlitros de solución de biotina diluida en un tampón de bloqueo celular durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Luego, incubar las células con 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios que contienen anticuerpo anti alfa tubulina de rata y anticuerpo de cadena pesada anti clatrina de conejo durante 16 horas a cuatro grados centígrados o una hora a temperatura ambiente. Luego incubar células con 100 microlitros de solución de anticuerpos secundarios que contienen anclajes trifuncionales, burro anti conejo dig MA y burro anti rata biotina MA durante una hora a temperatura ambiente. Incubar células con 100 microlitros de glutaraldehído al 0,25% durante 15 minutos a temperatura ambiente para anclar las proteínas en el hidrogel.
Retire la estructura superior de la placa de 16 pocillos con la cuchilla de afeitar o cualquier herramienta de extracción de su elección y mantenga el vidrio de la cubierta inferior. Coloque el vidrio de la cubierta en una placa de Petri y colóquelos sobre hielo. Agregue 45 microlitros de una solución de monómero a cada pocillo para acondicionar las células.
Incubar en hielo durante cinco minutos. Para hacer la solución de gelificación, prepare un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mezcle monómero, agua destilada doble y 10% T med.
No agregue el amonio por sulfato todavía. Mientras tanto, mantenga el tubo de solución de gelificación en el hielo. Agregue persulfato de amonio al 10% a la solución de gelificación.
Pipetear inmediatamente 40 microlitros de solución de gelificación en cada pocillo mientras almacena un tubo de solución de gelificación en hielo. Coloque la placa del pozo en hielo durante tres minutos más. Para mantener la humedad del gel durante la incubación de 37 grados centígrados, cubra la placa de Petri con la tapa y ponga unas gotas de agua en la placa de Petri.
Mientras protege la muestra de la luz, mueva el vidrio de la cubierta y la placa de Petri de 10 centímetros a una incubadora de 37 grados centígrados durante 1,5 horas para la gelificación. Después de la gelificación, corte el vidrio de la cubierta para separar cada gel. Transfiera los geles a seis placas de pozo.
Agregue dos mililitros de tampón de digestión a cada pozo. Deje las muestras durante la noche a temperatura ambiente o durante cuatro horas a 37 grados centígrados. Luego lave los geles con al menos 10 veces el exceso de volumen de agua que el volumen final del gel mientras repite el paso de lavado cuatro veces durante 20 a 30 minutos cada vez, y el gel se expande aproximadamente cuatro veces en cada dimensión.
Incubar geles en dos mililitros de volumen de tampón de tinción de estreptavidina digoxigenina con dos a cinco colorantes micromolares de estreptavidina y/o colorante antidigoxigenina durante 24 horas a temperatura ambiente mientras se mantienen las muestras en la oscuridad. Luego lave y expanda el gel de dos a cuatro veces con agua excesiva. Cada lavado toma alrededor de 30 minutos a una hora.
Para facilitar la visualización de las células bajo microscopía fluorescente, tiñe las células con DAPI durante el tercer lavado. Diluir el stock de DAPI en uno a 5, 000 delirios en el agua de lavado. Incubar el gel con una solución DAPI durante 30 minutos a una hora.
Luego lavar dos veces adicionales con tres mililitros de agua. Cubra la cámara de imágenes del fondo de vidrio de seis pozos con tres mililitros de polilisina al 0,01% para inmovilizar las muestras de gel. Luego, transfiera muestras de gel a la cámara de imágenes codificadas y obtenga una imagen de las muestras con cualquier endoscopio de fluorescencia deseado.
La microscopía de expansión de retención de etiquetas muestra un etiquetado de fluorescencia mejorado en comparación con la microscopía de expansión de retención de proteínas o las muestras de microscopía de expansión de biotina. La microscopía de expansión de retención de etiquetas muestra una señal de fluorescencia aproximadamente seis veces mayor en comparación con la microscopía de expansión de retención de proteínas. LR-ExM puede capturar eficazmente estructuras pequeñas, como pozos recubiertos de clatrina con resolución de límite de subfracción.
Los microtúbulos y los hoyos recubiertos de clatrina fueron tinciones coinmuno utilizando anclajes funcionales, NHS MA dig y NHS MA biotina. Del mismo modo, los hoyos recubiertos de clatrina y las mitocondrias se marcaron utilizando un enfoque de etiqueta de proteína enzimática con anclajes trifuncionales, como la biotina BG MA y BC MA dig. Además, el enfoque basado en la inmunotinción y el enfoque de etiqueta de proteína enzimática se combinan para mostrar la estructura de la lamina A / C y el complejo de nucleoporos.
La microscopía de expansión de retención de etiquetas se realizó en el tejido cerebral del ratón mediante la tinción co-inmuno del marcador presináptico, Fagot, y el marcador postsináptico, Homer 1. Las dos etiquetas eran claras y estaban bien separadas, lo que admite alta resolución y eficiencia de etiquetado. La microscopía de expansión de retención de mano de obra es un método versátil y robusto, que se puede combinar con cualquier otra microscopía de expansión introducida anteriormente.
Para imágenes de alta resolución, es importante lograr una buena eficiencia de etiquetado para capturar mejor la estructura de la escala molecular. La microscopía de expansión de retención de mano de obra es un método eficaz y robusto para mejorar la señal.
