El crecimiento de las células vegetales está controlado por las propiedades mecánicas de sus paredes celulares. Por lo tanto, es importante conocer estas propiedades en diferentes órganos y tejidos de las plantas. El método aquí presentado permite la caracterización biomecánica de paredes celulares no fijas y no deshidratadas en los tejidos internos de plantas jóvenes.
Comience con la preparación de las soluciones y la muestra para la sección de vibratomo. Vierta una capa de cuatro milímetros de agarosa derretida al 3% en el fondo de la placa de Petri y deje que se enfríe ligeramente para evitar daños térmicos en la muestra. Coloque horizontalmente sobre la agarosa tres o cuatro piezas de cinco milímetros de largo del órgano vegetal.
Alrededor de 30 a 60 segundos después, aparecerá una fina película semisólida sobre la primera capa de agarosa. Luego, vierta con cuidado una segunda capa en la parte superior. Después de que la agarosa esté completamente solidificada, corte el bloque que contiene la muestra.
Dé forma al bloque en una pirámide truncada hexagonal para garantizar su estabilidad durante la sección posterior. Antes de comenzar la sección de la muestra con el vibratomo, pegue el bloque a la etapa de vibratomo con adhesivo de cianoacrilato. Coloque el escenario en el vibratomo, de modo que una de las esquinas de la pirámide se enfrente a la hoja del vibratomo y vierta agua en el baño de vibratomo.
Establezca los parámetros de seccionamiento como el grosor de la sección, la velocidad de la cuchilla y la frecuencia de vibración y corte la muestra. Con un cepillo fino, mueva la sección del baño de agua a un tobogán de vidrio y coloque una gota de agua en la sección para evitar que se seque. Después de verificar la calidad de la sección bajo un microscopio óptico, seleccione la sección adecuada que tenga la pared celular perpendicular al plano de sección.
Luego inmovilice la sección para mediciones de microscopía de fuerza atómica vertiendo una capa de un mililitro de agarosa fundida al 1% en el fondo de la tapa de la placa de Petri con una pipeta. Después de que la agarosa se haya solidificado, retire el exceso de agua de la sección llevando el papel de filtro a su borde. Transfiera con cuidado la sección de la diapositiva al centro de la tapa de la placa de Petri con un cepillo.
Luego agregue cuidadosamente 1% de agarosa alrededor de la sección usando una pipeta de 20 microlitros y vierta el agua u otra solución para la microscopía de fuerza atómica en la tapa de la placa de Petri con la sección inmovilizada. Guiar la muestra bajo el voladizo de microscopía de fuerza atómica utilizando el microscopio óptico. Haga clic en el botón Aproximación y luego en el botón Aterrizaje para acercarse a la muestra en modo de contacto con un punto de ajuste de un nanoamperio.
Haga clic en el botón Escanear y luego en el botón Área. Seleccione el tamaño de área de 50 micrómetros por 50 micrómetros para escanear. Haga clic en el botón Mover sonda y compruebe toda el área de escaneo moviendo el escáner sobre él y encontrando el punto más alto según el grado de protuberancia del escáner.
Abra la pestaña Enfoque. Luego haga clic en el botón Eliminar para retractarse de la muestra. Usando el punto más alto como objetivo, haga clic en el botón Aterrizaje para acercarse de nuevo a la muestra.
A continuación, compruebe la superficie de nuevo haciendo clic en el botón Mover sonda y moviendo el escáner sobre ella. Establezca la velocidad de escaneo en 0.5 hertzios y establezca el tamaño de escaneo en 50 micrómetros por 50 micrómetros y el punto de escaneo en 64 por 64. Haga clic en el botón Ejecutar y escanee para verificar la superficie de la muestra y su posible contaminación con agarosa.
Después de hacer clic en el botón Activado, elija el modo HDPlus en el menú desplegable en la ventana principal del programa y establezca el punto de ajuste en 0.1 nanoamperios en la ventana principal del programa. En la pestaña principal de la ventana HD, establezca los parámetros de escaneo apropiados para la muestra estudiada. Luego abra la pestaña Ruidos en la ventana HD e ingrese la frecuencia de resonancia del voladizo.
Abra la pestaña Quant de la ventana HD e ingrese el IOS, la rigidez en voladizo, el radio de la punta y el ángulo. Seleccione el modelo de contacto, que se utilizará para los cálculos en función de la geometría de la punta. Después de esto, abra la pestaña Escanear de la ventana HD y seleccione las señales, así como la dirección en la que se graba la señal.
Marque la casilla Forzar volumen para obtener un registro de todas las curvas de fuerza y haga clic en el botón Apagado en la parte superior de la ventana principal del programa para activar el bucle de retroalimentación Haga clic en el botón Phase Core en la ventana principal de HD para corregir la sensibilidad del sistema óptico. La pestaña Versus Time de la ventana principal de HD presenta la función de la señal DFL versus tiempo en tiempo real. Seleccione las partes de esta función que se utilizarán para la determinación del nivel de referencia y para ajustar el modelo de contacto para cálculos posteriores.
Ahora, establezca el valor del punto de escaneo en 256 por 256 en la ventana principal del programa. Luego, establezca la velocidad de escaneo en 0.2 hertz y haga clic en el botón Ejecutar para escanear la muestra. Después de que se detenga el escaneo, haga clic en el botón Activado en la parte superior de la ventana principal para desactivar el bucle de retroalimentación.
Elija Modo de contacto en el menú desplegable, abra la pestaña Enfoque y haga clic en el botón Eliminar para retirarse de la muestra. Haga clic en el botón Datos para abrir el software de análisis y guardar la salida. Abra el archivo guardado en el software de análisis.
Seleccione el fotograma de volumen de fuerza HD. Mantenga pulsada la tecla Control y seleccione un fotograma visual obtenido en la misma dirección de escaneo. Haga clic en el botón Cargar mapa externo para ver dónde se encuentran las paredes celulares.
Compruebe InvOptSens y los valores de rigidez en voladizo en la pestaña principal. Abra la pestaña Adicional y verifique los parámetros de la punta y el modelo de contacto. Haga clic en varios puntos de las paredes celulares en el marco visual y seleccione solo aquellas curvas bien descritas por el modelo.
Las áreas blancas en el mapa de módulos corresponden a una sobreestimación errónea del módulo de Young debido a que el escáner alcanza su límite en la dirección Z. Esta imagen no es conveniente para ser utilizada como un mapa externo para una selección adicional de curvas de fuerza satisfactorias. Sin embargo, el mapa de señal DFL presentado a la derecha es más adecuado aquí.
Diferentes instrumentos pueden referirse a las señales DFL como señales de desviación o error. El escáner que se ha extendido completamente al intentar llegar a la parte inferior de la muestra puede provocar mediciones erróneas e incluso escaneos interrumpidos. La presencia de agarosa se puede verificar mientras se obtiene el primer escaneo en el modo de contacto, ya que las paredes celulares y algunos fondos celulares son visibles en dichos escaneos.
Sin embargo, en caso de inmovilización inexacta, la superficie puede cubrirse con agarosa, que enmascara la topografía de la muestra. De cuatro curvas de fuerza diferentes registradas en diferentes puntos de la misma pared celular, la curva registrada en 0.1 no muestra una línea de base, lo que significa que no hay separación de la punta en voladizo de la pared celular. La curva registrada en 0,3 muestra un hombro en la parte que se aproxima que indica la flexión de la pared celular.
Los puntos dos y cuatro muestran curvas de fuerza satisfactorias con valores de módulos similares. La preparación y el examen de la muestra requieren práctica, pero se puede dominar. Una parte crucial de este protocolo es filtrar las curvas resultantes.
No confíe en los módulos, que se calcularon automáticamente. La misma técnica se puede utilizar para medir las fuerzas de adhesión o disipación de energía. También puede ser importante para la descripción de la viscosa o el comportamiento viscoelástico de algunos materiales.
