El objetivo general de este protocolo es caracterizar bioquímicamente la actividad de la tRNA-Isopentenyl Transferase In Vitro. Este método es útil para la detección in vitro y la caracterización de la actividad de tRNA-isopentenyl transferase de enzimas recombinantes purificadas. La principal ventaja de esta técnica es que es un ensayo simple y directo utilizado para detectar una modificación covalente del ARN.
Aunque este método proporciona información sobre la actividad de tRNA-isopentenyl transferase, es potencialmente adaptable para la caracterización bioquímica de enzimas modificadoras de ARN o de amplio rango. El primer paso en este procedimiento es limpiar a fondo las placas de vidrio que se utilizarán para la fundición del gel. Lave las placas con agua y jabón, enjuague bien con agua desionizada y luego limpie las placas con isopropanol y toallitas sin pelusas.
A continuación, montar las placas y espaciadores. Mezclar los siguientes reactivos para hacer un gel de 100 mililitros 20%acrilamida, 7,5 molares, 1x gel TBE. 80 mililitros de concentrado de gel de urea, 10 mililitros de diluyente de gel de urea y 10 mililitros de tampón de gel de urea.
Añadir 40 microlitros de T-med y 800 microlitros de 10% de persulfato de amonio recién preparado a la mezcla. Dibuje la solución de gel en una jeringa grande y dispense la solución de gel entre las placas de vidrio que se roscan en el vidrio mientras dispensa la solución para evitar la formación de burbujas. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de que el gel se haya solidificado, planta el gel en un aparato de gel vertical. Llene las cámaras tampón superior e inferior con 1x TBE. Dos horas antes de cargar el gel, pre-ejecutar el gel a 20 miliamperios durante dos horas para permitir que el límite del búfer se ejecuten los oligonucleótidos más pequeños.
Preparar cada reacción para el ensayo de isopentenilación de ARN en un volumen final de 17 microlitros. Añadir a cada tubo 50 milivolor Tris-HCl, pH 7,2, 1,2 ATP milimiolar, 5,8 cloruro de magnesio milimiolar, 0,2 DMAPP milimétrica, inhibidor de 10 unidades de lana, 40, 000 CPM internamente 32P etiquetado ARN, 5,3 micromolar Mod5, y 1,2 milimolar 2-mercptoetanol. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados durante una hora.
Después de una hora, el etanol precipita la RNase usando 2,5 volumen de 100%etanol y 1/10 volumen de 3,5 molar de acetato de sodio pH 5.5, y lo coloca negativo 20 grados Celsius durante una hora durante la noche. A continuación, centrifugar las muestras de ARN a 15, 400 g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave cada pellet de ARN con 500 microlitros de 70% etanol.
Centrifugar las muestras a 15, 400 g y cuatro grados celsius durante cinco minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y seque al aire los pellets de ARN durante 15 minutos o hasta que todo el etanol se haya evaporado. A continuación, vuelva a suspender cada pellet de ARN en 10 microlitros de ocho urea molares.
Añadir 150 unidades de RNase T1 a cada muestra e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue dos microlitros de búfer de carga 6x a cada muestra. Cargue 10 microlitros de cada muestra de ARN en un gel de urea precocida, 20% poliacrilamida y 7,5 molares.
Ejecuta el gel a 25 miliamperios durante dos horas. Después de dos horas, detenga la electroforesis y retire el gel del aparato. Romper el sello entre las dos placas de vidrio y retirar cuidadosamente una de las placas de vidrio con el gel restante en cualquiera de las placas.
Coloque una capa de envoltura de plástico sobre el gel y exponga en una pantalla de fósforo durante tres horas. Este protocolo detecta de forma fiable la isopentenilación de residuos de ARN no canónico y no canónico modificados por la S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. En este ejemplo tyrosina tRNA fue etiquetado internamente con 32P-adenosina y Mod5 fue incubado con RNase en presencia o ausencia de DMAPP.
Los ARN se digerieron con RNase T1 y se resolvieron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Mod5 modifica el residuo predicho en presencia de DMAPP e indicado por el 10 nucleótido desplazado, triple adenosina que contiene fragmento en las posiciones de nucleósidos 36 a 38 contienen fragmento en el TRNA tirosina. La adenosina modificada 37 reside se indica con un asterisco.
Del mismo modo, cuando el ARN de serina se incuba con Mod5 y DMAPP, se observa un desplazamiento completo de los 10 nucleótidos triple adenosina que contiene fragmento en la posición de nucleósido 36 a 38. Curiosamente, se observa un desplazamiento parcial de un fragmento de siete nucleótidos que no contiene el triple adenosina que contiene fragmento en las posiciones de nucleósidos 36 a 38, lo que sugiere que el fragmento de adenosina triple que contiene en la posición del nucleósido 36 a 38 secuencia y la estructura puede no ser necesaria para la actividad in vitro Mod5. Una vez dominada esta técnica tomará de dos, cuatro a seis horas días si se realiza correctamente.
Al intentar bien este procedimiento es importante recordar mantener y monitorear la integridad del ARN, porque la degradación del ARN podría afectar la modificación del ARN y confundirá la interpretación de los datos. Después de este procedimiento, se podrían realizar estudios mutacionales con la enzima de interés para determinar los residuos o dominios específicos necesarios para la actividad enzimática. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN, digan las actividades de tRNA-isopentenyl transferase de enzimas procarióticas y eucariotas.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo el protocolo para la detección de la actividad de la isopentenyl transferase de su enzima de interés. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como usar un EPP adecuado, usar un blindaje adecuado y eliminar la radiactividad correctamente siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.
