Este protocolo prueba la eficacia de desinfección del lavado de agua caliente. Puede ayudar a evaluar si una lavadora y secadora son adecuadas para limpiar la ropa contaminada por un virus. La principal ventaja de esta técnica de lavado es que se puede replicar en otros laboratorios a menor escala utilizando procedimientos que han pasado por el proceso de garantía de calidad.
Demostrando el procedimiento estarán Ahmed Abdel-Hady, microbiólogo, Mariela Monge y Jonathan Sawyer, científicos investigadores, y otros de nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare el agar de soja tríptico modificado pesando y mezclando los ingredientes en agua desionizada como se describe en el texto. Luego, agregue un mililitro de alícuota Phi6 concentrada sin diluir al agar blando y 100 microlitros de un cultivo de pseudomonas syringae en fase logarítmica.
A continuación, vierta agar blando sobre la superficie de una placa de agar de soja tríptica modificada solidificada con un diámetro de 100 milímetros. Evite burbujas o derrames girando suavemente las placas y distribuyendo el agar blando uniformemente sobre la superficie del agar sólido. Después de la incubación nocturna a temperatura ambiente, raspe suavemente el contenido de las tres placas con un esparcidor de células estéril en un tubo estéril de crónica de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de tampón SM.
Vortex los tubos en el ajuste máximo durante uno o dos minutos para romper el agar y luego centrifugarlos durante 15 minutos a 7, 000 veces G.Luego recoger el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacene el sobrenadante filtrado como alícuotas de un mililitro en crioviales a 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Realice una evaluación visual previa a la prueba midiendo y registrando la longitud y el ancho de los equipos de protección personal o artículos de EPP sin lavar en varios lugares.
Para la inoculación, prepare una solución de extracto de carne al 10% disolviendo un gramo de extracto de carne en un volumen total de 10 mililitros de 1X PBS. Filtro esterilizar todo el volumen de la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,2 micras. A continuación, dentro del gabinete de bioseguridad, inocule los cupones de prueba y control positivo con aproximadamente 10 a la séptima unidad formadora de placa por muestra pipeteando una cantidad de 10 microlitros de la solución en el artículo de EPP como gotas múltiples y extendiendo la gota usando la punta de la pipeta.
Caliente la solución de lavado a 50 grados centígrados con una placa caliente y una barra de agitación. Luego mida y registre el pH y la temperatura de la solución de lavado y recoja 10 mililitros de solución para verificar la esterilidad. Luego, vierta 3.25 litros de solución de lavado en una lavadora esterilizada.
Coloque los artículos de EPP, una cubierta facial inoculada y cuatro máscaras de película no contaminadas sin cupones en la lavadora. Después de lavar los artículos de EPP durante 18 minutos, drene la lavadora y enjuague tres veces con cinco litros de agua del grifo a temperatura ambiente cada vez para eliminar la espuma. Agregue 3.25 litros de agua del grifo esterilizada a temperatura ambiente en la lavadora y realice un ciclo de enjuague de nueve minutos de duración.
A continuación, mueva los artículos del EPP al lado de giro de la lavadora para girar durante cinco minutos. Seque los artículos de EPP durante 80 minutos en el ajuste de calor alto de 93 grados centígrados en la secadora. A continuación, mueva los elementos de EPP de la secadora al espacio de trabajo estéril.
Retire asépticamente los cupones de los artículos inoculados y colóquelos en tubos cónicos. A continuación, extrae los cupones en 10 mililitros de caldo neutralizante 10%Dey-Engley mediante vórtice durante dos minutos al ajuste máximo del equipo. Para emplatar los extractos utilizando un método convencional de recubrimiento de agar de tapa blanda, agregue alícuotas de muestra de prueba al tubo de agar blando que contiene seis mililitros de agar blando y 100 microlitros de jeringas de fase logarítmica P.
A continuación, vierta el agar blando sobre la superficie de una placa de agar de soja tríptica modificada solidificada y distribuya uniformemente el agar blando sobre la superficie del agar sólido girando la placa. Después de la incubación nocturna a temperatura ambiente, enumere manualmente las unidades de plataforma en cada placa. Las pruebas sistemáticas de laboratorio para evaluar la efectividad del lavado de la desinfección viral de EPP o ropa de tamaño completo, mostraron que la unidad de plataforma o el recuento de placas PFU y el volumen de muestra extraído permitieron el cálculo del número de unidades de plataforma por cupón de prueba.
Los resultados de la recuperación viral representativa se obtuvieron para una prueba de cubierta facial. Las pruebas de lavado proporcionaron información sobre las propiedades del material, como el estiramiento o la contracción de las prendas de vestir y los datos de calidad controlada del protocolo. La eficacia del lavado de agua caliente para desinfectar cubiertas faciales, mezclilla y materiales de EPP de limpieza de Phi6 se demostró en este gráfico donde las estrellas denotan la desinfección completa.
Es importante utilizar técnicas asépticas durante todo este procedimiento para evitar la contaminación cruzada. Además, los tiempos de secado del inóculo para los cupones son únicos para cada material y se establecen antes de la prueba. Otros métodos complementarios incluyen pruebas de microscopía y penetración de líquidos para explorar la degradación del material o evaluaciones de tamaño adicionales que garanticen que la protección de la barrera aún se ajuste al usuario.
Esta técnica proporcionó la base para ampliar la eficacia del lavado y las pruebas de materiales para prendas de vestir y artículos de EPP a gran escala. También puede ayudar a establecer procedimientos efectivos de lavado durante otro evento de contagio o pandemia.
