Capture Hi-C позволяет расшифровать организацию 3D-хроматина исследуемой геномной области размером с мегабазу с высоким разрешением. С помощью Capture Hi-C достигается более высокое разрешение и специфичность аллелей при одновременном повышении эффективности времени и доступности метода. Применение Capture IC к различным модельным системам, типам клеток и регулируемым развитием хроматиновым ландшафтам в здоровом и патологическом состоянии, вероятно, облегчит наше понимание взаимодействия между топологией генома и регуляцией генов.
Для начала трифтонизируйте и подсчитайте клетки с контрольной пластины, подготовленной специально для подсчета клеток, с помощью автоматического счетчика клеток. Включите окрашивание жизнеспособности, чтобы определить процент жизнеспособных клеток. Исходя из этого количества ячеек, оцените общее количество ячеек в табличке, подготовленной для сшивания.
Извлеките питательную среду из пластин, подготовленных для сшивания, и замените ее фиксирующим раствором. Зафиксируйте на 10 минут при комнатной температуре при аккуратном перемешивании на шейкере. Погасите фиксированную реакцию, добавив 2,5 моляра глицина PBS к конечной концентрации 0,125 моляра.
Добавьте 530 микролитров 2,5-молярного глицина PBS к 10 миллилитрам в 10-сантиметровой пластине. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, аккуратно перемешивая на шейкере. Переложите тарелки на лед и выдерживайте еще 15 минут на льду, аккуратно перемешивая на шейкере.
Удалите фиксирующий раствор из ячеек, налив его в стакан, чтобы обеспечить быструю обработку. Быстро промойте 10-сантиметровую пластину два раза пятью миллилитрами холодного 0,125 молярного глицина PBS, чтобы смыть мусор и мертвые клетки. Удалите жидкость с тарелки, налив ее в стакан, чтобы обеспечить быструю обработку.
Добавьте пять миллилитров холодного 0,125 молярного глицина PBS в 10-сантиметровую пластину. И быстро соскребать ячейки с пластины с помощью пластикового скребка для клеток. Перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденную коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров с помощью серологической пипетки.
Дважды промойте пластину пятью миллилитрами холодного 0,125 молярного глицина PBS и добавьте клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку. Отжимайте при 480 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость путем аспирации с помощью настольной системы аспирации.
Ресуспендируют клетки и аликвотируют 500 микролитров клеточной суспензии в расчетное количество микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 миллилитра. Отжимайте при температуре 480 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и храните гранулы с сухими ячейками при температуре 80 градусов Цельсия. Для лизиса клеток разморозьте замороженные гранулы на льду.
Приготовьте 1,5 миллилитра буфера лизиса в воде. Добавьте 600 микролитров холодного буфера для лизиса и хорошо ресуспендируйте на льду. Открутите при температуре 2 655 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость с помощью настольной системы аспирации.
Ресуспендирование в 100 микролитрах 0,5% SDS. После инкубации при 62 градусах Цельсия, вращаясь при 1400 об/мин в течение 10 минут, добавьте 290 микролитров воды плюс 50 микролитров 10% Triton X 100 и хорошо перемешайте, избегая пузырьков воздуха. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с завихрением при 1400 об/мин в течение 10 минут, прежде чем добавить 50 микролитров буфера для пробирки 10 X DPN и перевернуть пробирку для перемешивания.
Возьмите 50 микролитров непереваренной ДНК для контроля качества в отдельную пробирку. Не забудьте взять непереваренную контрольную пробу. Для переваривания DPN2 добавьте 10 микролитров DPN2 высокой концентрации и перемешайте инвертированием.
Инкубируйте образцы и непереваренный контроль в термическом смесителе при температуре 37 градусов Цельсия, вращаясь со скоростью 1400 оборотов в минуту более четырех часов. Для лигирования и реверсирования сшивания берут 50 микролитров лигированной переваренной ДНК для контроля качества в отдельной пробирке. Храните непереваренный и нелигированный контрольный материал при температуре 20 градусов Цельсия.
Добавьте 800 микролитров коктейля для лигирования. Инкубируйте при 16 градусах Цельсия, вращаясь со скоростью 1000 оборотов в минуту в течение ночи. Для очистки ДНК перенесите образцы на льду в предварительно охлажденные 15-миллилитровые конические центрифужные пробирки и добавьте два миллилитра воды, 10,5 миллилитров ледяного этанола и 583 микролитра трехмолярного ацетата натрия.
Добавьте 200 микролитров ледяного этанола, 10,8 микролитров ацетата натрия и один микролитр соосаждителя к непереваренному и лигированному контролю качества. Инкубировать при температуре минус 80 градусов по Цельсию не менее четырех часов до ночи. Вращайте 15-миллилитровые пробирки при 2200 G при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут.
Осторожно удалите этанол и высушите образцы и контрольные элементы на воздухе при комнатной температуре в течение 10–15 минут. Не пересушивайте. Ресуспендируют образцы и контрольные элементы в 100 микролитрах и 20 микролитрах воды соответственно.
Для контроля качества подготовки шаблона 3С загрузите от 100 до 200 нанограмм каждого образца и каждого контроля на 1%-ный гель agros 1XTBE. Затем, чтобы выполнить целевое обогащение для секвенирования с урезанным концом, возьмите четыре микрограмма шаблона 3C, ресуспендируйте его в 130 микролитрах воды для каждой реакции захвата. Обработайте образец ультразвуком и продолжите подготовку с тремя микрограммами срезанной ДНК.
Для гибридизации подготовленных образцов ДНК с целевыми РНК-зондами используют 750 нанограммов образцов ДНК в конечном объеме 3,4 микролитра, в результате чего начальная концентрация составляет 221 нанограмм на микролитр. Используйте скоростную вакуумную концентрацию, если это необходимо, чтобы достичь конечного объема 3,4 микролитра. Для образцов, повторно взвешенных в 10 микролитрах, достаточно концентрации от 15 до 20 минут.
Инкубируйте гибридизационную смесь от 16 до 18 часов при температуре 65 градусов Цельсия с нагретой крышкой при температуре 105 градусов Цельсия в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы захватить целевые фрагменты лигирования, добавьте стрептивид в связанных шариках в гибридизированный образец зонда. Наконец, чтобы подготовить образцы для мультиплексного секвенирования, продолжайте протокол в соответствии с целевой системой обогащения, используемой в этом исследовании для парного и мультиплексного секвенирования.
Разрешение карты взаимодействия Capture Hi-C позволяет идентифицировать два меньших домена в Tsix-tad, который содержит промотор локуса Tsix. Ранее это не было достигнуто с помощью 5C. Более того, из данных Capture Hi-C отчетливо видны другие субтадные структуры, такие как контактные петли, такие как петля между Xist и FTX, ранее идентифицированная с Capture C, и петля между Xist и Xert, недавно идентифицированная с использованием аналогичного протокола для Capture Hi-C.
Другие контакты также могут быть отображены более точно из-за повышенного разрешения профилей Capture Hi-C, таких как те, которые образуют известные контактные горячие точки в Tsix-tad между локусами Linx, Chic1 и Xite. По сравнению с показанными данными Hi-C, Capture Hi-C позволил увеличить разрешение в четыре раза, но потребовал только одной четверти глубины секвенирования. Очень важно не забыть взять 50 микролитров непереваренных и нелигированных образцов ДНК в качестве контроля качества подготовки шаблона 3С.
