Capture Hi-Cは、目的のメガベースサイズのゲノム領域の3Dクロマチン組織を高解像度で解読することができます。Capture Hi-Cを使用すると、より高い分解能と対立遺伝子特異性が得られ、時間効率と手頃な価格が向上します。Capture ICをさまざまなモデルシステム、細胞型、および健康および病理学的状態における発生的に調節されたクロマチンランドスケープに適用することで、ゲノムトポロジーと遺伝子制御の間の相互作用の理解が容易になる可能性があります。
まず、自動セルカウンターを使用して、細胞カウント用に特別に準備されたコントロールプレートから細胞をトリフトナイズしてカウントします。生存細胞の割合を決定するために生存率染色を含む。この細胞数から、架橋のために調製したプレート中の細胞の総数を推定する。
架橋用に準備したプレートから培養液を取り出し、固定液と交換します。振とう機で穏やかに混合しながら室温で10分間固定します。2.5モルのグリシンPBSを最終濃度0.125モルまで添加することにより、固定反応をクエンチします。
530マイクロリットルの2.5モルグリシンPBSを10センチメートルプレートの10ミリリットルに加える。室温で5分間インキュベートし、シェーカーで穏やかに混合します。プレートを氷に移し、シェーカーで穏やかに混合しながら、氷上でさらに15分間インキュベートします。
固定溶液をビーカーに注いで細胞から取り除き、迅速な取り扱いを確保します。10センチメートルのプレートを5ミリリットルの冷たい0.125モルのグリシンPBSで2回すばやくすすぎ、破片や死んだ細胞を洗い流します。液体をビーカーに注ぎ、プレートから液体を取り除き、迅速な取り扱いを確保します。
5ミリリットルの冷たい0.125モルグリシンPBSを10センチメートルプレートに加える。そして、プラスチックセルスクレーパーを使用してプレートからセルをすばやくこすり落とします。血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を予冷50ミリリットルの円錐形遠心管に移します。
プレートを5ミリリットルの冷たい0.125モルグリシンPBSで2回すすぎ、細胞懸濁液を円錐形遠沈管に加えます。摂氏4度で10分間480Gでスピンダウンします。ベンチトップ吸引システムで吸引して上清を除去します。
細胞を再懸濁し、500マイクロリットルの細胞懸濁液を計算された数の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分注します。摂氏4度で10分間480倍Gでスピンダウンし、乾燥セルペレットを摂氏80度で保管します。細胞溶解のために、凍結ペレットを氷上で解凍する。
1.5ミリリットルの溶解バッファーを水中で調製します。600マイクロリットルのコールドリシスバッファーを加え、氷上でよく再懸濁します。摂氏4度で5分間2, 655 Gでスピンダウンし、ベンチトップ吸引システムを使用して上清を除去します。
100マイクロリットルの0.5%SDSに再懸濁します。摂氏62度で1400 RPMで10分間旋回してインキュベートした後、290マイクロリットルの水と50マイクロリットルの10%Triton X 100を加え、気泡を避けてよく混ぜます。摂氏37度で1400 RPMで10分間旋回させてから、50マイクロリットルの10 X DPNチューブバッファーを加え、チューブを反転させて混合します。
品質管理のために50マイクロリットルの未消化DNAを別のチューブに入れます。未消化の対照サンプルを採取することを忘れないでください。DPN2消化のために、10マイクロリットルの高濃度DPN2を加え、反転させて混合します。
サンプルと未消化のコントロールを摂氏37度のサーマルミキサーでインキュベートし、毎分1400回転で4時間以上旋回させます。架橋のライゲーションと反転のために、品質管理のために50マイクロリットルのライゲーションされた消化DNAを別のチューブに入れます。未消化および結紮されていないコントロールを摂氏20度で保管します。
800マイクロリットルの結紮カクテルを追加します。摂氏16度でインキュベートし、一晩毎分1000回転で渦巻く。DNA精製のために、サンプルを氷上で15ミリリットルの円錐形遠心管に予冷し、2ミリリットルの水、10.5ミリリットルの氷冷エタノール、および583マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムを加えます。
200マイクロリットルの氷冷エタノール、10.8マイクロリットルの酢酸ナトリウム、および1マイクロリットルの共沈殿剤を未消化および結紮された品質管理に追加します。摂氏マイナス80度で少なくとも4時間から一晩インキュベートします。15ミリリットルのチューブを2200 Gで摂氏4度で45分間回転させます。
エタノールを注意深く除去し、サンプルとコントロールを室温で10〜15分間風乾します。過度に乾燥させないでください。サンプルとコントロールをそれぞれ100マイクロリットルと20マイクロリットルの水に再懸濁します。
3Cテンプレート調製の品質管理のために、各サンプルおよび各コントロールの100〜200ナノグラムを1%agros 1XTBEゲルにロードします。次に、pared末端マルチプレックスシーケンシングのターゲット濃縮を実行するために、4マイクログラムの3Cテンプレートを取り、捕捉反応ごとに130マイクロリットルの水に再懸濁します。サンプルを超音波処理し、剪断されたDNAの3マイクログラムで調製を続けます。
調製したDNAサンプルを標的特異的RNAプローブにハイブリダイズするには、最終容量3.4マイクロリットルで750ナノグラムのDNAサンプルを使用し、その結果、1マイクロリットルあたり221ナノグラムの初期濃度が得られます。3.4マイクロリットルの最終容量を達成するために必要に応じて速度真空濃度を使用してください。10マイクロリットルに再懸濁されたサンプルの場合、15〜20分の濃縮で十分です。
製造元の指示に従って、ハイブリダイゼーション混合物を摂氏65度で16〜18時間インキュベートし、蓋を摂氏105度で加熱します。標的ライゲーションフラグメントを捕捉するには、結合ビーズ中のストレプチビドをプローブハイブリダイズサンプルに追加します。最後に、マルチプレックスシーケンシング用のサンプルを準備するために、ペアおよびマルチプレックスシーケンシングのためにこの研究で使用されたターゲットエンリッチメントシステムに従ってプロトコルを継続します。
キャプチャHi-C相互作用マップの解像度により、Tsix遺伝子座のプロモーターを含むTsix-tad内の2つの小さなドメインを同定できます。これは、以前は5Cでは達成されませんでした。さらに、コンタクトループなどの他のサブタッド構造は、以前にキャプチャCで識別されたXistとFTXの間のループや、キャプチャHi-Cの同様のプロトコルを使用して最近特定されたXistとXertの間のループなど、キャプチャHi-Cデータから明確に確認できます。
Linx、Chic1、およびXite遺伝子座間のTsix-tad内の既知の接触ホットスポットを形成するものなど、Capture Hi-Cプロファイルの解像度が向上したため、他の接触もより正確にマッピングできます。表示されたHi-Cデータと比較して、Capture Hi-Cは分解能を4倍に向上させることができましたが、シーケンス深度の4分の1しか必要としませんでした。3Cテンプレート調製の品質管理として、50マイクロリットルの未消化および結紮されていないDNAサンプルを採取することを忘れないでください。
