Nos gustaría dar las gracias a los Dres. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andrés Barria y la señora Ximena Optiz-Araya para la asistencia inicial con la configuración del protocolo y para proporcionar plásmidos. Este trabajo fue apoyado por NIH / NIDCD subvención DC013841 (JTS).

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Northwestern, y llevados a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud Pautas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Manejo de huevos <ol><li> Compre huevos fertilizados de un vendedor local. Almacene los huevos a 13 ° C en un refrigerador por no más de 5 días antes de la incubación. La viabilidad del embrión disminuye significativamente después de 1 semana. </li><li> Limpie cada huevo con etanol al 70% antes de colocarlo en la incubadora. </li><li> Coloque 1-2 docenas de huevos en sus lados en una incubadora con la temperatura establecida a 38 ° C a ~ 50% de humedad. Esto asegura el posicionamiento correcto del embrión para la electroporación y la viabilidad óptima, respectivamente. NOTA: Después de 48-52 h de incubación, los huevos estarán en el estadio Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 y listos para la electroporación. </li></ol> 2. Preparación <ol><li> Plasmid MiXing <ol><li> Añadir 1 μl de 0,1% de verde rápido (0,1% en 18 MΩ de H2O desionizada y destilada [ddH 2 O]) por cada 7 μl de mezcla de ADN. </li><li> Para co-electroporación de múltiples plásmidos, mezclar los plásmidos en una proporción de 1: 1. La concentración final de ADN debería ser de 5-8 μg / μl. </li></ol></li><li> Pieza de inyección de llenado <ol><li> Tire las pipetas de un extractor de micropipeta. Llene la pipeta con 1-2 μ l de plásmidos con una jeringa 28G aguja. </li><li> Retirar la punta de la pipeta a 10 - 20 μm usando una pinza. Utilice un microscopio para ayudar a determinar el tamaño de la punta de la pipeta rota. Conecte la pipeta al porta-pipeta del picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Ventana NOTA: El procedimiento de ventana se ha publicado antes de 13 . Consulte la referencia 13 para obtener información visual adicional. <ol><li> Limpie todos los instrumentos y el área de trabajo con un 70%etanol. </li><li> Tome el número deseado de huevos puestos fuera de la incubadora (entre 6-10), deje a temperatura ambiente, y los huevos de torunda individualmente con etanol 70% otra vez. Los huevos permanecen viables por lo menos 2 horas después de la remoción de la incubadora. </li><li> Coloque el huevo encima de un iluminador de luz para identificar la posición del embrión. Encierre en un círculo el centro del área oscura ( es decir , embrión) con un lápiz. </li><li> Usando una aguja 19G, empuje un agujero en el extremo romo del huevo. </li><li> Poke otro agujero cerca del círculo dibujado en el lado puntiagudo del huevo. Retire una pequeña pieza de la cáscara de huevo externa (aproximadamente 16 mm 2 ) con la aguja 19G y luego extraiga un pequeño pedazo de la cáscara de huevo interna (unos 8 mm 2 ) con fórceps. </li><li> Con una jeringuilla de 3 ml equipada con una aguja 19G, extraer 1,5-2,5 ml de albúmina del huevo a través del agujero de extremo romo. Asegúrese de inclinar la aguja hacia abajo a 45 °. </li><li> Cubra el orificio de extremo romo con un pequeño trozo de cinta adhesiva (1 cm x 1 cm). Cubrir el círculo dibujado unD el segundo agujero con cinta (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Con las tijeras curvadas (filo = 2.5 cm), corte una ventana dentro del círculo. Las tijeras deben estar paralelas a la cáscara del huevo y el diámetro de la ventana debe ser inferior a 2 cm. </li></ol> 4. Inyección de plásmido <ol><li> Encienda el picospritzer. Ajuste la presión a 18 psi y la duración a 5 μs. Encienda el tanque de aire y la lámpara para el microscopio de disección. </li><li> Haga 30 mL de solución madre de una dilución de 1:10 de tinta china comprada en la tienda mezclada en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Almacenar a 4 ° C. La inyección de tinta china es un paso importante para obtener una mejor visualización del embrión de pollo. <ol><li> Llene una jeringa de 1 ml con la solución diluida de tinta china. Conecte una aguja de 27G y expulsar cualquier burbuja que esté presente en la jeringa. </li><li> Inserte la aguja justo debajo de la membrana de la yema ~ 2 - 3 mm del embrión e inyecte ~ 0.2 ml de tinta india suavemente debajo del embrión. HacerNo inyecte más de 0,5 ml de tinta china, ya que puede disminuir la supervivencia del embrión. </li></ol></li><li> Coloque el huevo con ventana en un porta-huevo debajo del microscopio de disección. Utilice la ampliación más alta para una mejor visualización del sitio de inyección del plásmido. </li><li> Usando fórceps, retire la membrana sobre el área de inyección. Las regiones auditivas del tallo cerebral de interés ( es decir , NM y NL) surgen de Rhombomeres 5 y 6 (R5 / R6). R5 / R6 se encuentran adyacentes a los otocistos (una estructura embrionaria en vertebrados que se desarrolla en el oído interno) que sirven como puntos de referencia para las inyecciones de plásmido R5 / R6. </li><li> Baje la pipeta llena de ADN en el tubo neural que recubre la región R5 / R6 y entre los otocitos usando el micromanipulador. En la figura 1A se muestra un esquema de colocación ideal. </li><li> Aplicar presión de aire (18 psi, 5 μs de duración) desde el picospritzer para expulsar el ADN en el tubo neural. </li></ol> 5. Electroporación <ol><li> EncenderEl estimulador de corriente / voltaje. </li><li> Llene una jeringa de 3 ml con PBS y coloque el filtro de la jeringa. Añadir 1-2 gotas de PBS en el embrión. </li><li> Baje el electrodo bipolar al embrión utilizando el micromanipulador con el electrodo negativo por encima del punto de inyección (medial) y el electrodo positivo lateral al R5 / R6 ( Figura 1A ). Evite el contacto directo con el embrión. Utilice electrodos bipolares donde el material del electrodo sea platino iridio. Ajuste la distancia entre las puntas a 0,5 mm con pinzas. </li><li> Utilizando un estimulador de corriente / voltaje, pulse 20 veces a 50 V durante 1 ms a intervalos de 1 s. </li><li> Después de la electroporación, añadir una gota de PBS sobre el área expuesta. Retire suavemente el electrodo y límpielo con un tejido de laboratorio y etanol al 70%. Cierre la ventana exponiendo el embrión con cinta adhesiva. </li><li> Etiquetar la cáscara de huevo con el tipo de plásmido inyectado y la fecha de eclosión. </li><li> Coloque los huevos en la incubadora con el lado de la ventana hacia arriba. Incubar a 38 ° C con 50% De humedad hasta que se alcance la fase de desarrollo deseada. </li><li> Si un vector tet-on es electroporado para el control temporal de la expresión génica, aplique Doxycycline (Dox) cada 24 h para inducir la expresión génica (ver Sección 6). </li></ol> 6. Sistema Tet-on para el control temporal de la expresión génica <ol><li> Utilizar los siguientes plásmidos: PCAGGS-T2TP: un plásmido que expresa la transposasa. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plásmido que expresa de manera estable la proteína de unión a Dox. PT2K-BI-TRE-EGFP: un plásmido que contiene una expresión promotora de tet-on bidireccional (TRE) del reportero EGFP y un segundo gen de interés. NOTA: Los tres plásmidos anteriores tienen que ser co-electroporados en una relación 1: 1: 1. </li><li> Preparación de la solución madre: <ol><li> Disolver el Dox en PBS estéril para producir una solución madre de 1 mg / mL. Almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Aplicación Dox: <ol><li> Para inducir el expresioN del gen de interés durante ciertas etapas de desarrollo, aplicar Dox cada 24 h. </li><li> Al aplicar Dox, saque el huevo, abra la ventana, pipetee 50 μL de Dox sobre la membrana corioalointoica, cierre la ventana y vuelva a colocar el huevo en la incubadora. </li></ol></li></ol> 7. Preparación de la zona de disección para las rebanadas de tronco encefálico NOTA: Los siguientes apartados (7 - 9) y procedimientos han sido publicados antes de 14 . Consulte estas referencias para obtener información visual adicional. <ol><li> Preparar una solución de agar (40 mg / ml de agarosa, es decir , 4% en ddH 2 O). Vierta la solución de agar en una placa de Petri y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Guarde la placa de agar cubierta en el refrigerador para su uso futuro durante el corte del tallo cerebral del tejido. </li><li> Flujo espinal cerebral artificial de burbujas continuas (ACSF) con 95% de O 2 y 5% de CO 2 (pH 7,2-7,4 y osmolaridad: 295-310 mOsm / L).</li><li> Limpiar el área de trabajo y vibratome con EtOH al 70% y enjuagar la cuchilla con agua destilada. </li><li> Coloque una almohadilla de absorción de líquidos limpia en el área de trabajo con las herramientas de disección apropiadas. </li><li> Saque la placa de agar de la nevera, corte un pequeño cubo de agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Pegue el bloque de agar a la etapa de una cámara vibratome-slicing usando superglue comercialmente disponible. </li></ol> 8. Aislamiento del tronco encefálico auditivo del pollo <ol><li> Abra el huevo en el sitio de la ventana grabada. Perfore el saco de membrana con un bisturí y retire la cabeza del embrión de pollo. </li><li> Decapitar el pollo con las tijeras afiladas. </li><li> Coloque la punta de la hoja de afeitar ligeramente posterior a los ojos. Inciso a través del cráneo en la línea media rostral a caudal. Aplique una ligera presión dependiendo de la edad del embrión. Los embriones más viejos requieren más presión. </li><li> Empuje suavemente la piel y las plumas para exponer el cráneo y verifique el corte de la línea media. </li><li> AplicandoPresione la parte rostral del cráneo con una cuchilla de afeitar. Coloque inmediatamente la hoja posterior a los ojos y corte a través de todo el cráneo y el tejido cerebral. </li><li> Haga incisiones de la línea media a la lateral con tijeras en la región caudal del cráneo, ligeramente anterior a los músculos del cuello de ambos lados de la cabeza, exponiendo el cerebro y el cerebelo retirando el cráneo y el exceso de tejido. </li><li> Corte el tejido unido al tronco cerebral con unas tijeras y retire el tronco encefálico, que se desprende libremente del cráneo. </li></ol> 9. Preparación de rebanadas de tronco encefálico para la electrofisiología o imagenología in vivo <ol><li> Pin abajo del tronco encefálico a través de la tecta óptica. </li><li> Retire el cerebelo cortando los pedúnculos con una tijera, exponiendo el suelo del cuarto ventrículo. </li><li> Usando pinzas, retire cualquier tejido membranoso y vasos sanguíneos de la superficie del tronco encefálico. </li><li> Para bloquear el tronco encefálico, haga un corte horizontal en el extremo más rostral del piso de los cuatroVentricular, sólo caudal a la corteza. Hacer cortes laterales perpendiculares a través de la tecta óptica para aislar el tronco encefálico. </li><li> Coloque una pequeña cantidad de super pegamento en la etapa vibratome directamente en frente del bloque de agar. </li><li> Levante el tronco encefálico en la médula espinal con pinzas y colóquelo en el super pegamento con el lado rostral hacia abajo y el lado dorsal hacia la lámina vibratomo. Retire el exceso de pegamento con un papel de laboratorio o papel de filtro. </li><li> Vierta ACSF oxigenado en la etapa vibratome. Coloque la cuchilla vibratome en un ángulo de 20-22 °. Comience vibratome en la oscilación de máxima amplitud. Mueva el escenario hacia la cuchilla para que la parte superior del tejido esté paralela a la hoja. </li><li> Rápidamente mueva la cuchilla hacia el tejido del tronco encefálico. Reduzca lentamente la hoja considerablemente antes de que la cuchilla entre en contacto con el tejido. </li><li> Corte el tejido con la velocidad de avance más lenta posible. Una vez que la cuchilla esté a través de toda la sección de tejido coronal, retire suavemente la rebanada usando una pipeta de transferencia &lt;Li <li> Baje la platina 200-300 μm y corte nuevamente. Repita hasta que las marcas anatómicas de los núcleos auditivos se vuelvan visibles, por ejemplo, la región distinta del neuropilo dorsal / ventral de NL y la localización medial de NM con respecto a NL. </li><li> Mantenga cuidadosamente las rebanadas en ACFS. Esto se puede hacer a temperatura ambiente (22 ° C) o cerca de condiciones fisiológicas (~ 41 ° C) usando un baño de agua caliente. Observe el orden de corte. La primera rebanada corresponde a la región más caudal del tejido y la última rebanada corresponde a la región más rostral. Esto representa aproximadamente la organización tonotópica del tronco encefálico auditivo, de regiones de codificación de baja a alta frecuencia, respectivamente. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

In ovo electroporación es un método de expresar o derribar los genes de interés con el fin de analizar in vivo la función génica [ 8 , 9] . En el embrión de pollo, es un método innovador para expresar genes codificados por plásmidos en diferentes regiones auditivas del tronco cerebral 8 . Para asegurar una expresión óptima, se requieren varios pasos críticos. En primer lugar, sólo inyectar embriones cuyos oto...

La codificación neuronal rápida del sonido es esencial para las funciones auditivas normales. Estas incluyen las habilidades de localización de sonido 1 , el habla en la discriminación de ruido 2 , y la comprensión de otras señales de comunicación relevantes para el comportamiento 3 . Las neuronas análogas ubicadas en el tronco encefálico auditivo de aves y mamíferos son altamente especializados para la codificación neuronal rápida [ 4] . Estos incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM), el núcleo laminaris (NL) y sus análogos de mamíferos, el núcleo coclear anteroventral (AVCN) y el olivo medial superior (MSO), respectivamente 5 . Sin embargo, los mecanismos de desarrollo que regulan la codificación neural rápida son mal entendidos en el tronco encefálico auditivo. Por lo tanto, es ventajoso estudiar genes específicos que son responsables de la codificación neural rápida con el fin de comprender mejor su expresión, regulación y función en auDesarrollo territorial. El embrión de pollo en desarrollo es una herramienta de investigación eficaz y bien establecida para estudiar las cuestiones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo 6 , 7 . Recientes avances moleculares han abordado estas cuestiones biológicas en el embrión de pollo en desarrollo mediante la expresión o derribar a los genes de interés con el fin de analizar la función de genes in vivo [ 8 , 9] . La investigación del papel regulador de genes específicos es un avance significativo en la comprensión de patologías asociadas con déficit auditivo. Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmido en el tronco encefálico auditivo de pollo donde la codificación neuronal rápida del sonido se produce 10 . Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con los rhombomeros 5 y 6 11 , 12 (R5 /R6), se muestra el control espacial de la transfección de plásmidos en NM y NL. Además, se muestra la regulación temporal de la expresión mediante la adopción de un sistema de vector tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox) [ 8] .

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

La electroporación es un método que introduce genes de interés en organismos biológicamente relevantes como el embrión de pollo. Se ha establecido que el embrión de pollo es un modelo de investigación eficaz para estudiar las funciones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo. Más recientemente, el embrión de pollo se ha vuelto particularmente valioso en el estudio de la expresión génica, la regulación y la función asociada con la audición. En ovo la electroporación se puede utilizar para dirigir las regiones auditivas del tronco cerebral responsables de funciones auditivas altamente especializadas. Estas regiones incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM) y el núcleo laminaris (NL). NM y NL neuronas surgen de distintos precursores de rhombomeres 5 y 6 (R5 / R6). Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmidos para estudiar las propiedades relacionadas con el gen en estas regiones. Se muestra un método para el control espacial y temporal de la expresión génica que promueven la ganancia o pérdida de funcional fenotipoEs Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con R5 / R6, se muestra la transfección de plásmidos en NM y NL. La regulación temporal de la expresión génica puede conseguirse adoptando un sistema vectorial tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox). La técnica de electroporación in ovo - junto con los ensayos funcionales bioquímicos, farmacológicos y / o in vivo - proporciona un enfoque innovador para estudiar el desarrollo de las neuronas auditivas y los fenómenos patofisiológicos asociados.

Se muestra aquí que en la electroporación ovo permite la expresión génica en un sistema biológico que se desarrolla normalmente. Los genes codificados por plásmidos se inyectan focalmente en el tubo neural que recubre R5 / R6. En la Figura 1A se muestra un ejemplo esquemático de las colocaciones de electrodo y pipeta con respecto a marcadores anatómicos importantes. La ubicación correcta de la inyección de plásmido se confirma 24 horas despu?...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K vistas.  Northwestern University.  Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo. 

Video: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

Preparación y Cultura de rebanadas de pollo tronco cerebral auditivo

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Neurociencias

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biología

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

Cortar el tronco cerebral auditivo embrionario del pollo para evaluar gradientes tonotópicos y microcircuitos

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

Evaluación de la respuesta auditiva del tronco encefálico en crías de pollo

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

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