Nuestro protocolo nos permite medir directamente el metabolismo postprandial en la linfa mesentérica que fluye. Esto es poderoso porque podemos determinar cuantitativamente el movimiento de nutrientes desde el intestino delgado hacia la linfa. Y podemos medir citoquinas, lípidos dietéticos, otros componentes dietéticos y linfocitos.
Esta técnica puede ayudarnos a diseccionar la dinámica de los lípidos dietéticos que se mueven hacia la linfa, la síntesis y secreción de quilomicrones. El modelo de un día presentado aquí tiene varias ventajas. En primer lugar, reduce el tiempo experimental.
En segundo lugar, reduce el estrés animal. Aumenta la supervivencia animal. Y en general, disminuye el número experimental.
Demostrando nuestra técnica hoy estará nuestro cirujano de laboratorio senior, el Sr. Nick Dedousis. Y nuestro científico investigador, el Dr. Lihong Teng. Después de preparar al ratón para la cirugía, agarre la piel con pinzas y haga una incisión abdominal en la línea media con tijeras pequeñas.
Luego, corte hacia el esternón y hacia abajo hasta la grasa inguinal. Usando el retractor, mueva las vísceras peritoneales fuera del camino hasta que el conducto linfático sea visible. Usando una punta Q empapada en solución salina, mueva el hígado hacia el lado superior derecho del cuerpo y los intestinos y el estómago a la izquierda del animal.
Luego exponga la arteria mesentérica superior y el conducto linfático intestinal estirando el duodeno transversalmente hacia la izquierda. Prepare un tubo de cánula de 30 a 40 centímetros de longitud insertando una aguja roma. Luego, usando una jeringa de un mililitro, enjuague una pequeña cantidad de heparina a través del tubo y corte un bisel en la punta del tubo de la cánula con tijeras.
Luego, haga una incisión poco profunda y un conducto linfático para usar tijeras de iris como se describe en el manuscrito. Sostenga el tubo de la cánula con un par de pinzas finas e inserte suavemente el bisel de la punta en el conducto. Como el conducto linfático es frágil, use una gota de cianoacrilato para pegar la cánula linfática en la linfa mesentérica en lugar de atar el catéter con una sutura.
Ahora, usando una aguja de calibre 18, perfore un orificio a través de la región pilórica del estómago posterior al esfínter pilórico e inserte el tubo de infusión duodenal en el estómago de uno a dos milímetros más allá del esfínter pilórico en el duodeno. Luego, asegure el tubo al estómago con una ligadura de cuerda de bolso usando una sutura de seda 5/0 y sellado con una gota de pegamento de cianoacrilato para evitar fugas. Iniciar la infusión intraduodenal de 5% de glucosa y 0,9% de solución salina.
Reemplace los órganos en la cavidad corporal y suture la incisión de la línea media. Coloque el ratón suavemente en una sujeción de acurrucamiento. Proporcionar a los ratones una infusión intraduodenal continua de solución salina y glucosa durante una hora.
Revise la cánula para el flujo linfático y comience a ordeñar la cánula linfática para mantener el flujo linfático. Realizar la clásica infusión lipídica de un bolo de emulsión lipídica de 0,3 mililitros a través del tubo de infusión intraduodenal. Luego, cambie la infusión de nuevo a 5% de glucosa y 0.9% de solución salina a 0.3 mililitros por hora continuamente hasta el final del experimento.
Recoja las muestras de linfa y pese previamente los tubos de microcentrífuga durante 60 minutos y mantenga la linfa en hielo. Pese los tubos la segunda vez para establecer el peso de la linfa secretada cada 60 minutos. Recoja el estómago, el ciego y el colon y coloque cada órgano en un tubo de vidrio de 15 mililitros.
Divida el intestino delgado en tres o cuatro segmentos. Córtelo longitudinalmente y recoja el contenido luminal enjuagando el tejido con dos o tres mililitros de PBS frío. Retire la mucosa intestinal que comprende las células epiteliales y la lámina propia asociada de la capa muscular raspando cada sección en dos o tres mililitros de PBS frío con una pinza curva.
Coloque todos los tejidos, los aislados luminal y mucoso, y la capa muscular en tubos de vidrio. La concentración de triglicéridos en la linfa aumentó en respuesta a un bolo intraduodenal de 300 microlitros de SMOFlipid. La concentración máxima de triglicéridos se alcanza a las dos o tres horas después del bolo y disminuye constantemente durante el tiempo de seis horas.
La tasa de flujo linfático aumenta desde la infusión en bolo de tiempo cero hasta el final del experimento. Un objetivo importante de este protocolo era reducir el estrés animal, aumentar la tasa de supervivencia y disminuir el tiempo de anestesia. Para lograr esto, cambiamos las jaulas de sujeción Bollman por acurrucados, y agregamos humedad, calor y reposición de líquidos.
Nuestro protocolo de fístula de un día nos permite medir en tiempo real, in vivo, la dinámica de absorción de lípidos. También nos permite estudiar la diafonía de los órganos intestinales, el metabolismo, la absorción de nutrientes en la dieta y los fenotipos inmunes.
