Il nostro protocollo ci permette di misurare direttamente il metabolismo postprandiale nella linfa mesenterica fluente. Questo è potente perché possiamo determinare quantitativamente il movimento dei nutrienti dall'intestino tenue alla linfa. E possiamo misurare citochine, lipidi alimentari, altri componenti dietetici e linfociti.
Questa tecnica può aiutarci a sezionare la dinamica dei lipidi alimentari che si muovono nella linfa, la sintesi e la secrezione di chilomicroni. Il modello di un giorno presentato qui ha diversi vantaggi. In primo luogo, riduce il tempo sperimentale.
In secondo luogo, riduce lo stress animale. Aumenta la sopravvivenza degli animali. E nel complesso, diminuisce il numero sperimentale.
A dimostrare la nostra tecnica oggi sarà il nostro chirurgo di laboratorio senior, Mr.Nick Dedousis. E il nostro ricercatore, Dr.Lihong Teng. Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico, afferrare la pelle con una pinzetta e fare un'incisione addominale della linea mediana con piccole forbici.
Quindi, tagliare verso lo sterno e giù fino al grasso inguinale. Utilizzando il divaricatore, spostare i visceri peritoneali fino a quando il dotto linfatico è visibile. Utilizzando una punta Q imbevuta di soluzione salina, spostare il fegato verso il lato superiore destro del corpo e l'intestino e lo stomaco a sinistra dell'animale.
Quindi esporre l'arteria mesenterica superiore e il dotto linfatico intestinale allungando il duodeno trasversalmente verso sinistra. Preparare una lunghezza di 30-40 centimetri di tubi di cannula inserendo un ago smussato. Quindi, usando una siringa da un millilitro, sciacquare una piccola quantità di eparina attraverso il tubo e tagliare una smussatura sulla punta del tubo della cannula usando le forbici.
Quindi, fare un'incisione superficiale e un dotto linfatico usando le forbici dell'iride come descritto nel manoscritto. Tenere il tubo della cannula con un paio di pinze sottili e inserire delicatamente lo smusso della punta nel condotto. Poiché il dotto linfatico è fragile, utilizzare una goccia di cianoacrilato per incollare la cannula linfatica nella linfa mesenterica invece di legare il catetere con una sutura.
Ora, usando un ago calibro 18, forare un foro attraverso la regione pilorica dello stomaco posteriore allo sfintere pilorico e inserire il tubo di infusione duodenale nello stomaco uno o due millimetri oltre lo sfintere pilorico nel duodeno. Quindi, fissare il tubo allo stomaco con una legatura con corda di borsa usando una sutura di seta 5/0 e sigillato con una goccia di colla cianoacrilica per evitare perdite. Iniziare l'infusione intraduodenale di glucosio al 5% e soluzione salina allo 0,9%.
Sostituire gli organi nella cavità corporea e suturare l'incisione della linea mediana. Posizionare delicatamente il mouse in un sistema di ritenuta aderente. Fornire ai topi un'infusione intraduodenale continua di soluzione salina e glucosio per un'ora.
Controllare la cannula per il flusso linfatico e iniziare a mungere la cannula linfatica per mantenere il flusso linfatico. Eseguire la classica infusione lipidica di un bolo di emulsione lipidica da 0,3 millilitri attraverso il tubo per infusione intraduodenale. Quindi, riportare l'infusione al 5% di glucosio e allo 0,9% di soluzione salina a 0,3 millilitri all'ora continuamente fino alla fine dell'esperimento.
Raccogliere i campioni linfatici e pre-pesare le provette da microcentrifuga per 60 minuti e mantenere la linfa sul ghiaccio. Pesare i tubi la seconda volta per stabilire il peso della linfa secreta ogni 60 minuti. Raccogli lo stomaco, il cieco e il colon e posiziona ogni organo in un tubo di vetro da 15 millilitri.
Dividere l'intestino tenue in tre o quattro segmenti. Tagliarlo longitudinalmente e raccogliere il contenuto luminale risciacquando il tessuto con due o tre millilitri di PBS freddo. Rimuovere la mucosa intestinale che comprende le cellule epiteliali e la lamina propria associata dallo strato muscolare raschiando ogni sezione in due o tre millilitri di PBS freddo con una pinzetta curva.
Posizionare tutti i tessuti, gli isolati luminali e mucosi e lo strato muscolare in tubi di vetro. La concentrazione di trigliceridi nella linfa è aumentata in risposta a un bolo intraduodenale di 300 microlitri di SMOFlipid. La concentrazione di picco dei trigliceridi viene raggiunta a due o tre ore dopo il bolo e diminuisce costantemente durante il tempo di sei ore.
La velocità di flusso linfatico aumenta dall'infusione in bolo di tempo zero fino alla fine dell'esperimento. Uno degli obiettivi principali di questo protocollo era quello di ridurre lo stress degli animali, aumentare il tasso di sopravvivenza e diminuire il tempo di anestesia. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sostituito le gabbie di ritenuta Bollman per le coccole e abbiamo aggiunto umidità, calore e rifornimento di liquidi.
Il nostro protocollo di fistola zoppicante di un giorno ci consente di misurare in tempo reale, in vivo, le dinamiche di assorbimento dei lipidi. Ci permette anche di studiare la diafonia degli organi intestinali, il metabolismo, l'assorbimento dei nutrienti alimentari e i fenotipi immunitari.
