私たちのプロトコルでは、流れる腸間膜リンパの食後代謝を直接測定することができます。これは、小腸からリンパ液への栄養素の移動を定量的に決定できるため、強力です。また、サイトカイン、食事脂質、その他の食事成分、リンパ球を測定することができます。
この技術は、リンパ液に移動する食事脂質の動態、カイロミクロンの合成と分泌を分析するのに役立ちます。ここで紹介する1日モデルには、いくつかの利点があります。まず、実験時間を短縮します。
第二に、それは動物のストレスを軽減します。それは動物の生存率を高めます。そして全体的に、実験数が減少します。
今日、私たちの技術を実演するのは、シニアラボ外科医のニック・デドゥーシス氏です。そして、私たちの研究科学者、リホン・テン博士。マウスの手術の準備をした後、ピンセットで皮膚をつかみ、小さなハサミで腹部を正中切開します。
次に、胸骨に向かって鼠径脂肪まで切ります。開創器を使用して、リンパ管が見えるまで腹膜内臓を邪魔にならないように動かします。生理食塩水に浸したQチップを使用して、肝臓を体の右上に向かって動かし、腸と胃を動物の左側に動かします。
次に、十二指腸を左方向に横方向に伸ばして、上腸間膜動脈と腸リンパ管を露出させます。鈍い針を挿入して、長さ30〜40センチのカニューレチューブを準備します。次に、1ミリリットルの注射器を使用して、チューブを通して少量のヘパリンを洗い流し、ハサミを使用してカニューレチューブの先端でベベルを切ります。
その後、原稿に記載されているように虹彩ハサミを使用して浅い切開とリンパ管を作ります。カニューレチューブを細い鉗子で持ち、先端ベベルをダクトにそっと挿入します。リンパ管は壊れやすいので、カテーテルを縫合糸で結ぶのではなく、シアノアクリレートを一滴使用してリンパカニューレを腸間膜リンパに接着します。
次に、18ゲージの針を使用して、幽門括約筋の後方の胃の幽門領域に穴を開け、幽門括約筋の1〜2ミリメートルを超えて十二指腸に十二指腸注入チューブを挿入します。次に、シルク5/0縫合糸を使用して巾着結紮糸でチューブを胃に固定し、漏れを防ぐためにシアノアクリレート接着剤の滴で密封します。5%グルコースと0.9%生理食塩水の十二指腸内注入を開始します。
体腔内の臓器を交換し、正中線切開を縫合します。マウスを寄り添う拘束具にそっと置きます。生理食塩水とグルコースの十二指腸内注入を1時間マウスに提供します。
カニューレのリンパ流を確認し、リンパの流れを保つためにリンパカニューレの搾乳を開始します。十二指腸内注入チューブを介して0.3ミリリットルの脂質エマルジョンボーラスの古典的な脂質注入を実行します。次に、実験が終了するまで、注入を5%グルコースと0.9%生理食塩水に1時間あたり0.3ミリリットルで継続的に戻します。
リンパサンプルを収集し、マイクロ遠心チューブを60分間事前に計量し、リンパ液を氷上に保ちます。60分ごとに分泌されるリンパ液の重量を確立するために、2回目にチューブの重量を量ります。胃、盲腸、結腸を集め、各臓器を15ミリリットルのガラス管に入れます。
小腸を3つまたは4つのセグメントに分割します。それを縦方向に切り開き、2〜3ミリリットルの冷たいPBSで組織をすすぐことによって管腔内容物を集める。湾曲したピンセットで2〜3ミリリットルの冷たいPBSで各切片をこすることによって、上皮細胞および関連する固有層を含む腸粘膜を筋肉層から除去する。
すべての組織、管腔および粘膜分離株、および筋肉層をガラス管に入れます。リンパ液中のトリグリセリド濃度は、300マイクロリットルのSMOFlipidの十二指腸内ボーラスに応答して増加した。ピークトリグリセリド濃度は、ボーラス後2〜3時間で到達し、6時間を通じて着実に減少します。.
リンパ流速は、ボーラス注入の時間ゼロから実験の終わりまで増加する。このプロトコルの主な目標は、動物のストレスを減らし、生存率を高め、麻酔時間を短縮することでした。これを実現するために、ボルマン拘束ケージを寄り添うように切り替え、湿度、暖かさ、水分補給を追加しました。
当社の1日リンプ瘻プロトコルにより、in vivoの脂質吸収動態をリアルタイムで測定できます。また、腸内臓器のクロストーク、代謝、食事の栄養素吸収、免疫表現型を研究することもできます。
