Наш протокол позволяет нам напрямую измерять постпрандиальный метаболизм в проточной брыжеечной лимфе. Это мощно, потому что мы можем количественно определить движение питательных веществ из тонкой кишки в лимфу. И мы можем измерять цитокины, диетические липиды, другие диетические компоненты и лимфоциты.
Этот метод может помочь нам проанализировать динамику пищевых липидов, перемещающихся в лимфу, синтез и секрецию хиломикронов. Представленная здесь однодневная модель имеет ряд преимуществ. Во-первых, это сокращает время эксперимента.
Во-вторых, это снижает стресс животных. Это увеличивает выживаемость животных. И в целом, уменьшается экспериментальное число.
Сегодня нашу технику продемонстрирует наш старший хирург-лаборант г-н Ник Дедусис. И наш ученый-исследователь, доктор Лихонг Тенг. Подготовив мышь к операции, обхватите кожу пинцетом и сделайте разрез по средней линии живота маленькими ножницами.
Затем разрежьте по направлению к грудине и вниз к паховому жиру. С помощью ретрактора отодвиньте брюшные внутренности в сторону, пока не станет виден лимфатический проток. Используя ватную палочку, пропитанную физиологическим раствором, переместите печень в верхнюю правую часть тела, а кишечник и желудок - в левую сторону животного.
Затем обнажают верхнюю брыжеечную артерию и кишечный лимфатический проток, растягивая двенадцатиперстную кишку поперечно влево. Подготовьте трубку канюли длиной от 30 до 40 сантиметров, вставив тупую иглу. Затем с помощью шприца объемом один миллилитр промойте небольшое количество гепарина через трубку и вырежьте ножницами скос на кончике трубки канюли.
Затем сделайте неглубокий разрез и лимфатический проток с помощью ножниц радужной оболочки, как описано в рукописи. Удерживайте трубку канюли парой тонких щипцов и аккуратно вставьте скос наконечника в воздуховод. Поскольку лимфатический проток хрупкий, используйте каплю цианоакрилата, чтобы вклеить лимфатическую канюлю в брыжеечную лимфу вместо того, чтобы связывать катетер швом.
Теперь, используя иглу 18-го калибра, проколите отверстие в пилорической области желудка позади пилорического сфинктера и вставьте дуоденальную инфузионную трубку в желудке на один-два миллиметра за пилорический сфинктер в двенадцатиперстную кишку. Затем прикрепите трубку к желудку с помощью лигатуры, используя шелковый шов 5/0 и запечатав каплей цианоакрилатного клея, чтобы предотвратить утечку. Начните интрадуоденальную инфузию 5% глюкозы и 0,9% физиологического раствора.
Замените органы в полости тела и зашите срединный разрез. Аккуратно поместите мышь в прижимательное приспособление. Обеспечьте мышам непрерывную интрадуоденальную инфузию физиологического раствора и глюкозы в течение одного часа.
Проверьте канюлю на наличие лимфотока и начните доить лимфатическую канюлю, чтобы лимфа продолжала течь. Выполните классическую липидную инфузию болюсной липидной эмульсии объемом 0,3 миллилитра через интрадуоденальную инфузионную трубку. Затем переключите инфузию обратно на 5% глюкозы и 0,9% физиологического раствора со скоростью 0,3 миллилитра в час непрерывно до конца эксперимента.
Соберите образцы лимфы и предварительно взвесьте микроцентрифужные пробирки в течение 60 минут и держите лимфу на льду. Взвешивайте пробирки второй раз, чтобы установить вес выделяемой лимфы каждые 60 минут. Соберите желудок, слепую кишку и толстую кишку и поместите каждый орган в стеклянную трубку объемом 15 миллилитров.
Разделите тонкую кишку на три или четыре сегмента. Разрежьте его в продольном направлении и соберите содержимое просвета, промыв ткань двумя-тремя миллилитрами холодного PBS. Удалите слизистую оболочку кишечника, содержащую эпителиальные клетки и связанную с ними собственную пластинку, из мышечного слоя, соскоблив каждый участок в двух-трех миллилитрах холодного PBS изогнутым пинцетом.
Поместите все ткани, изоляты просвета и слизистой оболочки, а также мышечный слой в стеклянные трубки. Концентрация триглицеридов в лимфе увеличивалась в ответ на внутридуоденальный болюс 300 микролитров SMOFlipid. Пиковая концентрация триглицеридов достигается через два-три часа после болюса и неуклонно снижается в течение шести часов.
Скорость лимфотока увеличивается с момента нулевой болюсной инфузии до конца эксперимента. Основная цель этого протокола состояла в том, чтобы уменьшить стресс животных, повысить выживаемость и сократить время анестезии. Чтобы добиться этого, мы заменили удерживающие клетки Боллмана на прижимания и добавили влажность, тепло и пополнение жидкости.
Наш протокол однодневного вялого свища позволяет нам измерять в режиме реального времени, in vivo, динамику поглощения липидов. Это также позволяет нам изучать перекрестные помехи органов кишечника, обмен веществ, усвоение питательных веществ с пищей и иммунные фенотипы.
