Unser Protokoll ermöglicht es uns, den postprandialen Stoffwechsel in fließender mesenterialer Lymphe direkt zu messen. Dies ist sehr wichtig, da wir die Bewegung von Nährstoffen aus dem Dünndarm in die Lymphe quantitativ bestimmen können. Und wir können Zytokine, Nahrungslipide, andere Nahrungsbestandteile und Lymphozyten messen.
Diese Technik kann uns helfen, die Dynamik der Nahrungslipide, die in die Lymphe gelangen, die Synthese und Sekretion von Chylomikronen zu analysieren. Das hier vorgestellte Ein-Tages-Modell hat mehrere Vorteile. Erstens verkürzt es die Versuchszeit.
Zweitens reduziert es den Stress der Tiere. Es erhöht das Überleben der Tiere. Und insgesamt verringert sich die Anzahl der Experimente.
Unsere Technik wird heute von unserem leitenden Laborchirurgen, Herrn Nick Dedousis, demonstriert. Und unser wissenschaftlicher Mitarbeiter, Dr. Lihong Teng. Nachdem Sie die Maus auf die Operation vorbereitet haben, fassen Sie die Haut mit einer Pinzette und machen Sie mit einer kleinen Schere einen Bauchschnitt in der Mittellinie.
Schneiden Sie dann in Richtung Brustbein und bis zum Leistenfett. Bewegen Sie mit dem Retraktor die Peritonealeingeweide aus dem Weg, bis der Lymphgang sichtbar ist. Bewegen Sie die Leber mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen in Richtung der oberen rechten Körperseite und den Darm und den Magen auf die linke Seite des Tieres.
Legen Sie dann die Arteria mesenterica superior und den intestinalen Lymphgang frei, indem Sie den Zwölffingerdarm quer nach links dehnen. Bereiten Sie einen 30 bis 40 Zentimeter langen Kanülenschlauch vor, indem Sie eine stumpfe Nadel einführen. Spülen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Spritze eine kleine Menge Heparin durch den Schlauch und schneiden Sie mit einer Schere eine Fase an der Spitze des Kanülenschlauchs ab.
Machen Sie dann einen flachen Schnitt und einen flachen Lymphgang, um eine Irisschere zu verwenden, wie im Manuskript beschrieben. Halten Sie den Kanülenschlauch mit einer feinen Pinzette fest und führen Sie die Spitzenfase vorsichtig in den Kanal ein. Da der Lymphkanal brüchig ist, kleben Sie die Lymphkanüle mit einem Tropfen Cyanacrylat in die Mesenteriallymphe, anstatt den Katheter mit einer Naht zu binden.
Punktieren Sie nun mit einer 18-Gauge-Nadel ein Loch durch die Pylorusregion des Magens hinter dem Pylorusschließmuskel und führen Sie den Duodenal-Infusionsschlauch ein bis zwei Millimeter hinter dem Pylorusschließmuskel in den Magen in den Zwölffingerdarm ein. Befestigen Sie dann den Schlauch mit einer Ligatur aus Seide 5/0 am Magen und versiegeln Sie ihn mit einem Tropfen Cyanacrylatkleber, um ein Auslaufen zu verhindern. Beginnen Sie mit der intraduodenalen Infusion von 5 % Glukose und 0,9 % Kochsalzlösung.
Ersetzen Sie die Organe in der Körperhöhle und nähen Sie den Mittellinienschnitt. Legen Sie die Maus vorsichtig in eine Kuschelfessel. Geben Sie den Mäusen eine Stunde lang eine kontinuierliche intraduodenale Infusion von Kochsalzlösung und Glukose.
Überprüfen Sie die Kanüle auf Lymphfluss und beginnen Sie mit dem Melken der Lymphkanüle, um den Lymphfluss aufrechtzuerhalten. Führen Sie die klassische Lipidinfusion eines 0,3 Milliliter Lipidemulsionsbolus über das intraduodenale Infusionsröhrchen durch. Schalten Sie dann die Infusion bis zum Ende des Experiments kontinuierlich auf 5 % Glukose und 0,9 % Kochsalzlösung bei 0,3 Millilitern pro Stunde um.
Sammeln Sie die Lymphproben und wiegen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen 60 Minuten lang vor und halten Sie die Lymphe auf Eis. Wiegen Sie die Röhrchen ein zweites Mal, um das Gewicht der Lymphe zu bestimmen, die alle 60 Minuten ausgeschieden wird. Sammeln Sie den Magen, den Blinddarm und den Dickdarm und geben Sie jedes Organ in ein 15-Milliliter-Glasröhrchen.
Teilen Sie den Dünndarm in drei oder vier Segmente. Schneiden Sie es in Längsrichtung auf und sammeln Sie den luminalen Inhalt, indem Sie das Gewebe mit zwei bis drei Millilitern kaltem PBS abspülen. Entfernen Sie die Darmschleimhaut aus Epithelzellen und zugehöriger Lamina propria aus der Muskelschicht, indem Sie jeden Abschnitt mit einer gebogenen Pinzette in zwei bis drei Milliliter kaltem PBS abkratzen.
Legen Sie alle Gewebe, die luminalen und mukosalen Isolate und die Muskelschicht in Glasröhrchen. Die Triglyceridkonzentration in der Lymphe stieg als Reaktion auf einen intraduodenalen Bolus von 300 Mikrolitern SMOFlipid an. Die maximale Triglyceridkonzentration wird zwei bis drei Stunden nach dem Bolus erreicht und nimmt im Laufe der sechs Stunden stetig ab.
Die Lymphflussrate steigt von der Bolusinfusion bis zum Ende des Experiments an. Ein Hauptziel dieses Protokolls war es, den Stress der Tiere zu reduzieren, die Überlebensrate zu erhöhen und die Anästhesiezeit zu verkürzen. Um dies zu erreichen, haben wir Bollman-Rückhaltekäfige gegen Kuschelkäfige ausgetauscht und Feuchtigkeit, Wärme und Flüssigkeitsnachschub hinzugefügt.
Unser eintägiges Protokoll für schlaffe Fisteln ermöglicht es uns, die Dynamik der Lipidabsorption in Echtzeit in vivo zu messen. Es ermöglicht uns auch, die Wechselwirkungen zwischen den Darmorganen, den Stoffwechsel, die Nährstoffaufnahme über die Nahrung und die Immunphänotypen zu untersuchen.
