El protocolo aquí demostrado permite el etiquetado y aislamiento de linajes celulares específicos que están presentes en los folículos ováricos comenzando en etapas antrales tempranas, lo que permite el análisis y cultivo de alta resolución. Este enfoque altamente preciso utiliza combinaciones de anticuerpos conjugados fluoróforos para atacar marcadores de superficie celular que se expresan de manera robusta y específica entre los linajes discretos de granulosa, estroma y teca. Comience colocando el ovario en una placa de Petri estéril y vierta un medio frío con él para hidratar el tejido, asegurándose de que el ovario esté medio sumergido en el medio.
Retire cualquier sutura u otro material, y diseccionar el tejido circundante residual lejos del ovario. Para aislar los folículos antrales, identifique los folículos individuales y elija folículos sanos. Excluya cualquier folículo lleno de sangre, oscuro o no simétrico.
Aislar los folículos antrales elegidos del ovario usando bisturís, manteniendo el antro intacto y extirpando el tejido cortical que abarca el folículo. Coloque cada folículo antral intacto extirpado en un pocillo de la placa de seis pocillos. Usando una regla colocada debajo del plato, determine el diámetro del folículo con fines descriptivos.
Usando un bisturí, divida el folículo antral intacto para evaluar la cavidad antral y agregue seis mililitros de medio de desprendimiento de células enzimáticas antes de incubar la placa en una incubadora humidificada durante 10 minutos. Después de la incubación, agregue seis mililitros de medio disponible que contenga 20% de suero bovino fetal, o FBS, y enjuague con el medio con un pipeteo vigoroso repetido sobre los folículos biseccionados con una micropipeta P-1000. A continuación, recoge el medio y pásalo por un filtro de 100 milímetros.
Después de centrifugar el sobrenadante filtrado a 300 G y cuatro grados centígrados durante tres minutos antes, aspirar el sobrenadante. Coloque el tejido restante en una mezcla de 100 unidades por mililitro de colagenasa y una unidad por mililitro de dispasa diluida en una solución salina equilibrada antes de los 30 minutos de incubación. Interrumpir mecánicamente el tejido triturando y pipeteando vigorosamente dos veces después de 10 y 20 minutos.
Una vez hecho esto, recupere el tejido y enjuague mediante pipeteo, a través de una punta de micropipeta P-1000, y cuele a través de un filtro de 100 mililitros. Centrifugar el tejido tensado a 300 g y cuatro grados centígrados durante tres minutos antes de poner el pellet de células enriquecido con las células de teca y células de estroma en hielo para su etiquetado y FACS. Para identificar las células de la granulosa y las células de la teca, resuspender los gránulos celulares en una solución de bloqueo que contenga anticuerpos directamente conjugados e incubar a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Después de lavar y centrifugar las células, resuspender las células en tampón FACS que contiene 4-6 diamidino-2-fenilindol, o DAPI, y ejecutar la suspensión celular a través de un instrumento FACS para capturar una pequeña población de células, utilizando la intensidad fluorescente de anticuerpos conjugados fluoróforos para gating. Dividir el resto del ovario. Extirpe la médula con tijeras finas curvas y bisturís, evitando daños en la corteza ovárica.
Continúe el procesamiento y adelgazamiento de la corteza ovárica raspando suavemente hasta que quede una médula mínima. Divida el tejido cortical en tiras de dos a tres milímetros de ancho a lo largo de la longitud del ovario. Para la congelación del tejido ovárico, coloque una tira cortical en cada vial criogénico refrigerado que contenga la solución de congelación.
Agite los viales criogénicos que contienen las tiras corticales en una placa giratoria durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Nuclee la formación de cristales de hielo tocando cada vial criogénico con una punta de algodón brevemente sumergida en nitrógeno líquido. Se recolectaron las células ováricas y las fracciones celulares se clasificaron de los folículos antrales FACS a más del 95% de pureza.
Las células de la granulosa marcadas específicamente con CD99 en PVRL1, o nectina, se localizaron cada vez más en el compartimiento de células del oophorus granulosa a medida que los folículos antrales aumentaban de tamaño. Se observó que los anticuerpos contra la endoglina o CD55 demarcaban específicamente todas las células del estroma y la teca y que la alanina aminopeptidasa se expresaba específicamente por las células androgénicas de la teca. Las células se marcaron con un anticuerpo dirigido contra CD99 para identificar células de la granulosa y se utilizaron anticuerpos contra CD45 para excluir las células hematopoyéticas.
Los anticuerpos contra PVRL1 separaron la población de células de la granulosa en compartimentos oophorus y murales. Después de la digestión enzimática con colagenasa dispasa, las preparaciones celulares marcadas con anticuerpos contra CD55, CD34 y alanina aminopeptidasa permitieron la captura de todas las células del estroma o teca o células teca androgénicas con la exclusión de las células endoteliales de las poblaciones de células teca. Tenga especial cuidado para evitar interrumpir el antro de los folículos durante el aislamiento inicial del folículo cortando dentro de un margen seguro alrededor de los bordes del folículo.
Aguas abajo de este procedimiento, las células pueden utilizarse para análisis moleculares o de diagnóstico o, alternativamente, cultivarse in vitro para estudios de toxicología, análisis experimental o recapitulación del microambiente del folículo. Hasta la fecha, estos métodos se utilizaron para modelar trastornos endocrinos que involucran el ovario e identificar nuevas subpoblaciones de células asociadas al folículo.
