Burada gösterilen protokol, erken antral aşamalardan başlayarak yumurtalık foliküllerinde bulunan spesifik hücre soylarının etiketlenmesini ve izole edilmesini sağlar, böylece yüksek çözünürlüklü analiz ve kültürü mümkün kılar. Bu son derece hassas yaklaşım, ayrık granülosa, stroma ve teka soyları arasında sağlam ve spesifik olarak eksprese edilen hücre yüzey belirteçlerini hedeflemek için florofor konjuge antikorlarının kombinasyonlarını kullanır. Yumurtalıkları steril bir petri kabına yerleştirerek başlayın ve dokuyu nemlendirmek için soğutulmuş bir ortam dökün, yumurtalığın ortama yarı batırılmış olmasını sağlayın.
Herhangi bir dikişi veya başka bir materyali çıkarın ve kalan çevre dokuyu yumurtalıktan uzaklaştırın. Antral folikülleri izole etmek için, tek tek folikülleri tanımlayın ve sağlıklı folikülleri seçin. Kan dolu, koyu veya simetrik olmayan folikülleri hariç tutun.
Seçilen antral folikülleri neşter kullanarak yumurtalıktan izole edin, antrumu sağlam tutun ve folikülü çevreleyen kortikal dokuyu eksize edin. Eksize edilmiş her sağlam antral folikülü altı kuyucuk plakasının bir kuyucuğuna yerleştirin. Çanağın altına yerleştirilmiş bir cetvel kullanarak, tanımlayıcı amaçlar için folikül çapını belirleyin.
Bir neşter kullanarak, antral boşluğu değerlendirmek için sağlam antral folikülü ikiye bölün ve plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 dakika boyunca inkübe etmeden önce altı mililitre enzimatik hücre ayrılma ortamı ekleyin. İnkübasyondan sonra,% 20 fetal sığır serumu veya FBS içeren altı mililitre mevcut ortam ekleyin ve bir P-1000 mikropipet ile iki parçalı foliküller üzerinde tekrarlanan kuvvetli pipetleme ile ortamla yıkayın. Ardından, ortamı toplayın ve 100 milimetrelik bir filtreden geçirin.
Filtrelenmiş süpernatantı 300 G ve dört santigrat derecede üç dakika önce santrifüj ettikten sonra, süpernatanı aspire edin. Kalan dokuyu, 30 dakikalık inkübasyondan önce mililitre kollajenaz başına 100 birim ve mililitre dispaz başına bir birim karışıma dengeli bir tuzlu su çözeltisi içinde seyreltin içine yerleştirin. 10 ve 20 dakika sonra iki kez tritüre ve kuvvetli pipetleme yaparak dokuyu mekanik olarak bozar.
İşiniz bittiğinde, dokuyu geri kazanın ve pipetleme yoluyla, bir P-1000 mikropipet ucundan geçirin ve 100 mililitrelik bir filtreden süzün. Süzülmüş dokuyu 300 G ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca santrifüjleyin, ardından teca hücreleri ve stroma hücreleri ile zenginleştirilmiş hücre peletini etiketleme ve FACS için buz üzerine koyun. Granüloza hücrelerini ve teka hücrelerini tanımlamak için, hücre peletlerini doğrudan konjuge antikorlar içeren bir bloke edici çözelti içinde yeniden askıya alın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Hücreleri yıkadıktan ve santrifüj ettikten sonra, hücreleri 4-6 diamidino-2-fenilindol veya DAPI içeren FACS tamponunda yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu, gating için florofor konjuge antikorlarının floresan yoğunluğunu kullanarak, hücrelerin küçük bir popülasyonunu yakalamak için bir FACS cihazından geçirin. Yumurtalığın geri kalanını ikiye bölün. Medullayı kavisli ince makas ve neşterler kullanarak tüketin ve yumurtalık korteksine zarar vermekten kaçının.
Minimal medulla kalana kadar yumurtalık korteksinin işlenmesine ve inceltilmesine hafif kazıma ile devam edin. Kortikal dokuyu yumurtalık uzunluğu boyunca iki ila üç milimetre genişliğinde şeritlere bölün. Yumurtalık dokusunun dondurulması için, dondurma çözeltisini içeren her soğutulmuş kriyojenik şişeye bir kortikal şerit yerleştirin.
Kortikal şeritleri içeren kriyojenik şişeleri dönen bir plaka üzerinde dört santigrat derecede 20 dakika çalkalayın. Her kriyo şişesine kısaca sıvı azota batırılmış bir pamuk ucu ile dokunarak buz kristali oluşumunu nüklee edin. Over hücreleri toplandı ve hücre fraksiyonları antral foliküllerden FACS'den% 95'in üzerinde saflığa kadar sıralandı.
PVRL1 veya nektin içindeki CD99 spesifik olarak etiketlenmiş granüloza hücreleri, antral foliküllerin boyutu arttıkça oophorus granulosa hücre bölmesine giderek daha fazla lokalize olmuştur. Endoglin veya CD55'e karşı antikorların tüm stroma ve teka hücrelerini spesifik olarak sınırladığı ve alanin aminopeptidazın androjenik teka hücreleri tarafından spesifik olarak eksprese edildiği görüldü. Hücreler, granüloza hücrelerini tanımlamak için CD99'a yönelik bir antikor ile etiketlendi ve hematopoetik hücreleri dışlamak için CD45'e karşı antikorlar kullanıldı.
PVRL1'e karşı antikorlar, granüloza hücre popülasyonunu oofor ve duvar bölmelerine ayırdı. Kollajenaz dispaz ile enzimatik sindirimi takiben, CD55, CD34 ve alanin aminopeptidaza karşı antikorlarla etiketlenmiş hücre preparatları, endotel hücrelerinin teka hücrelerinin popülasyonlarından dışlanmasıyla tüm stroma veya teka hücrelerinin veya androjenik teka hücrelerinin yakalanmasını sağlamıştır. İlk folikül izolasyonu sırasında folikül sınırları etrafında güvenli bir marj içinde keserek foliküllerin antrumunu bozmamaya özellikle dikkat edin.
Bu prosedürün aşağısında, hücreler moleküler veya tanısal analiz için kullanılabilir veya alternatif olarak toksikoloji çalışmaları, deneysel analiz veya folikül mikroçevresinin özetlenmesi için in vitro olarak kültürlenebilir. Bugüne kadar, bu yöntemler yumurtalık ile ilgili endokrin bozuklukları modellemek ve folikül ile ilişkili hücrelerin yeni alt popülasyonlarını tanımlamak için kullanılmıştır.
