여기에서 입증된 프로토콜은 초기 전방 단계부터 난소 난포에 존재하는 특정 세포 계통의 표지 및 분리를 가능하게 하여 고분해능 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 이 고정밀 접근법은 형광단 접합 항체의 조합을 활용하여 개별 과립구, 기질 및 테카 계통 사이에서 강력하고 특이적으로 발현되는 세포 표면 마커를 표적으로 삼습니다. 난소를 멸균 페트리 접시에 넣고 차가운 배지를 부어 조직에 수분을 공급하여 난소가 배지에 반쯤 잠기도록 합니다.
봉합사나 기타 물질을 제거하고 잔여 주변 조직을 난소에서 해부합니다. antral follicles를 분리하려면 개별 모낭을 식별하고 건강한 모낭을 선택하십시오. 혈액이 채워진 모낭, 어둡거나 대칭이 아닌 모낭을 제외하십시오.
메스를 사용하여 선택한 전방 난포를 난소에서 분리하고 전방을 온전하게 유지하고 난포를 둘러싸고 있는 피질 조직을 절제합니다. 절제된 각각의 온전한 전방 난포를 6개의 웰 플레이트 중 하나의 웰에 놓습니다. 접시 아래에 놓인 자를 사용하여 설명을 위해 모낭 직경을 결정합니다.
메스를 사용하여 손상되지 않은 전방 난포를 이등분하여 전두강을 평가하고 6밀리리터의 효소 세포 분리 배지를 추가한 후 가습된 인큐베이터에서 플레이트를 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 20% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 사용 가능한 배지 6밀리리터를 추가하고 P-1000 마이크로피펫으로 이등분된 모낭에 반복적으로 격렬한 피펫팅을 하여 배지와 플러시합니다. 그런 다음 매체를 모아 100mm 필터에 통과시킵니다.
여과된 상층액을 300 G과 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡인한다. 나머지 조직을 100 밀리리터 콜라게나제와 1 밀리리터 디스파아제의 혼합물에 넣고 30 분 동안 배양하기 전에 균형 잡힌 식염수로 희석한다. 10분과 20분 후에 두 번 분쇄하고 격렬한 피펫팅을 하여 조직을 기계적으로 파괴합니다.
완료되면 조직을 회수하고 피펫팅, P-1000 마이크로피펫 팁을 통해 세척하고 100밀리리터 필터를 통해 걸러냅니다. 변형된 조직을 300G 및 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리한 후 라벨링 및 FACS를 위해 테카 세포와 기질 세포가 풍부한 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 과립구 세포와 theca 세포를 식별하기 위해 직접 접합 항체가 포함된 차단 용액에 세포 펠릿을 재현탁하고 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.
세포를 세척하고 원심분리한 후, 4-6 디아미디노-2-페닐인돌 또는 DAPI를 함유하는 FACS 완충액에 세포를 재현탁하고, 형광단 접합 항체의 형광 강도를 사용하여 세포의 작은 집단을 포획하기 위해 FACS 기기를 통해 세포 현탁액을 실행합니다. 난소의 나머지 부분을 이등분하십시오. 구부러진 미세한 가위와 메스를 사용하여 수질을 절제하여 난소 피질의 손상을 피하십시오.
최소한의 수질이 남을 때까지 부드럽게 긁어 난소 피질의 처리와 얇아짐을 계속하십시오. 피질 조직을 난소 길이를 따라 2-3 밀리미터 너비의 스트립으로 나눕니다. 난소 조직 동결의 경우, 냉동 용액이 들어있는 각 냉장 극저온 바이알에 하나의 피질 스트립을 넣습니다.
피질 스트립이 들어 있는 극저온 바이알을 섭씨 4도에서 20분 동안 회전판에 흔듭니다. 액체 질소에 잠깐 담근 면봉으로 각 극저온 바이알을 만져 얼음 결정 형성을 핵화합니다. 난소 세포를 수집하고, 전방 난포 FACS로부터 세포 분획을 95% 이상의 순도로 분류하였다.
PVRL1 또는 넥틴에서 특이적으로 표지된 CD99 과립구 세포는 전방 난포의 크기가 증가함에 따라 난소 과립구 세포 구획에 점점 더 국한되었습니다. 엔도글린 또는 CD55에 대한 항체는 모든 간질 및 테카 세포를 특이적으로 구분하고, 알라닌 아미노펩티다아제는 안드로겐성 테카 세포에 의해 특이적으로 발현되는 것으로 나타났다. 과립구 세포를 확인하기 위해 CD99에 대한 항체로 세포를 표지하고 조혈 세포를 배제하기 위해 CD45에 대한 항체를 사용했습니다.
PVRL1에 대한 항체는 과립구 세포 집단을 난포와 벽화 구획으로 분리했습니다. 콜라게나제 디스파스를 사용한 효소 분해 후, CD55, CD34 및 알라닌 아미노펩티다아제에 대한 항체로 표지된 세포 제제는 테카 세포 집단에서 내피 세포를 제외하고 모든 간질 또는 테카 세포 또는 안드로겐 테카 세포의 포획을 가능하게 했습니다. 난포 경계 주변의 안전한 여백 내에서 절단하여 초기 난포 격리 중에 난포의 antrum을 방해하지 않도록 특히 주의하십시오.
이 절차의 하류에서 세포는 분자 또는 진단 분석에 활용되거나 대안적으로 독성 연구, 실험 분석 또는 난포 미세 환경의 요약을 위해 시험관 내에서 배양될 수 있습니다. 현재까지 이러한 방법은 난소와 관련된 내분비 장애를 모델링하고 난포 관련 세포의 새로운 하위 집단을 식별하는 데 사용되었습니다.
