Este protocolo describe un método eficiente para aislar los folículos ováricos de las células del estroma circundantes para evaluar los análisis de expresión génica en estas células germinales. Esta técnica, que utiliza aislamientos enzimáticos y mecánicos controlados, permite la recuperación de folículos manteniendo su integridad. Siguiendo este protocolo, el investigador puede evaluar expresiones génicas específicas de estas células.
La técnica podría utilizarse para comprender mejor el déficit de expresión génica en los folículos relacionado con enfermedades que afectan la función ovárica o después de la exposición a agentes tóxicos. Comience a preparar una placa de seis pocillos agregando cinco mililitros de solución crioprotectora al primer pocillo y cinco mililitros de medio Leibovitz 15 con concentraciones decrecientes de crioprotector a los siguientes cuatro pocillos. Extraiga un vial que contenga un fragmento cortical ovárico de nitrógeno líquido de conformidad con las normas de seguridad.
Después de 30 segundos a temperatura ambiente, o RT, remoje el vial en agua destilada doble durante dos minutos. Dentro de una campana vertical, agite suavemente y abra el vial del fragmento cortical ovárico antes de transferir el contenido al primer pocillo de la placa de seis pocillos colocada en hielo. Luego, transfiera el fragmento cortical ovárico en el primer pocillo sucesivamente a cada pocillo de la placa de seis pocillos que contiene concentraciones decrecientes de crioprotector en cinco mililitros de Leibovitz 15 medio.
Agite suavemente el tejido en cada medio durante cinco minutos. Para el aislamiento del folículo, transfiera el tejido ovárico descongelado a una placa de Petri cuadriculada de dos milímetros llena con 10 mililitros de medio de disección, 30 microgramos por mililitro de penicilina G y 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. Ajuste el tamaño del tejido con el bisturí, si es necesario.
Apile las tres piezas de la cortadora de tejido y coloque el fragmento ovárico entre los dos bloques. Cortar el fragmento por la mitad con una cuchilla, deslizando a través de los bloques para obtener dos fragmentos de 0,5 milímetros de espesor. Corte el tejido con el picador de tejido para obtener las piezas más pequeñas.
Si es necesario, corte las piezas restantes manualmente con el bisturí hasta que el tejido se rompa. Una vez que el tejido se rompe, transfiera el tejido fragmentado a una placa de Petri cuadriculada llena de siete mililitros de medio de digestión antes de colocar el plato en la incubadora al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Tome la placa de Petri de la incubadora cada 10 minutos.
Enjuague el tejido pipeteando el medio de digestión hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Después de 45 minutos de incubación en el medio de digestión, coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico con un rango de aumento de cinco a 6.3 veces y recupere los folículos con una pipeta microcapilar. Seleccione los folículos de interés y aíslelos succionándolos con una pipeta bucal.
Si los folículos permanecen atrapados en un pedazo de corteza, aíslelos mecánicamente con dos jeringas de calibre 27 arrancando la corteza con la punta de las jeringas y liberando folículos del estroma. Usando el microcapilar, transfiera los folículos aislados a una placa de cuatro pocillos que contenga 15 microlitros del medio de cultivo calibrado cubierto por 500 microlitros de cultivo de aceite. Después de transferir de uno a 10 folículos, enjuáguelos dos veces en dos gotas de 15 microlitros de PBS cubiertos con 500 microlitros de cultivo de aceite durante cinco segundos cada uno.
Usando la pipeta bucal, recoja 20 folículos con PBS mínimo en un tubo vacío y mantenga el tubo en hielo. Después de 90 minutos de incubación en el medio de digestión, detenga la reacción enzimática agregando una solución de bloqueo en frío. Bajo la campana química, suspenda los folículos aislados en 100 microlitros de la solución de lisis provista con el kit de extracción de ARN.
Vortex los folículos aislados a 2500 RPM por minuto para romper su estructura, luego agregue 50 microlitros de 100% etanol al tubo. Y brevemente vortex el tubo a alta velocidad. Después del vórtice, transfiera el volumen total del tubo a un conjunto de cartucho de microfiltro, que comprende una columna y un tubo de recolección.
Y centrifugar el conjunto durante 10 segundos a 16, 363g a cuatro grados centígrados. Lave la columna con 180 microlitros de Wash Solution 1 provisto con el kit antes de centrifugar el tubo durante 10 segundos. Después de dar dos lavados de 180 microlitros de Wash Solution 2, 3 a la columna, seque el filtro centrifugando el tubo por última vez y coloque un nuevo tubo de recolección debajo del cartucho.
Para realizar la elución de los ácidos nucleicos, primero agregue ocho microlitros de solución de elución de 75 grados centígrados al conjunto del filtro. Después de un minuto, centrifugar el conjunto durante 30 segundos. Repita este paso con siete microlitros de Elution Solution.
Una vez hecho esto, agregue dos unidades internacionales DNasa y DNasa tampón al tubo e incube el tubo durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Bloquear la actividad enzimática con un reactivo de inactivación de DNasa de uno por 10 durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar el tubo durante 1,5 minutos a 16, 363 g a cuatro grados centígrados y transferir la suspensión que contiene el ARN a un nuevo tubo.
Usando un espectrofotómetro, evalúe la cantidad de ARN en la muestra. Use una solución de elución de microlitros como una solución en blanco y una solución de microlitro de ARN extraído de folículos aislados. Compruebe si la relación 260/280 es de alrededor de 2.0 para la pureza del ARN.
Y almacene la muestra a menos 80 grados centígrados o retrotranscriba directamente para realizar RT-qPCR. Utilizando este protocolo, se procesaron los dos fragmentos ováricos homogeneizados de 4x2x1 milímetros de la misma paciente para aislar los folículos. La cuantificación del ARN reveló que se extrajeron 4,8 nanogramos por microlitro de ARN total de folículos de menos de 75 micrómetros de tamaño con una relación de pureza de 1,89.
De los folículos de menos de 200 micrómetros, se extrajeron 10,5 nanogramos por microlitro de ARN total con una relación de pureza de 1,74. Los valores del número de integridad del ARN, o RIN, fueron 7.1 y 7.9 en los tubos uno y dos, respectivamente, validando la calidad del ARN de nuestras muestras. Después de ejecutar un ciclo estándar en un sistema de PCR en tiempo real, los umbrales de ciclo, o TC, obtenidos fueron 30,87 y 29,56 para HPRT, 33,5 y 31,77 para el ligando del kit, y 30,71 y 30,57 para GDF9.
La digestión enzimática del tejido es un punto crítico. El experimentador tiene que evaluar continuamente y asegurar la integridad del folículo durante la reacción deteniéndola cuando sea necesario. Además de los análisis de expresión génica, los folículos aislados se utilizan para desarrollar sistemas experimentales para preservar la fertilidad de los pacientes con cáncer, como el cultivo de folículos in vitro o el ovario artificial.
La técnica de aislamiento requirió una curva de aprendizaje para recuperar un alto número de folículos intactos. Se aconseja a los investigadores que se aseguren de que el tejido esté bien destrozado antes de la digestión.
