Показанный здесь протокол позволяет маркировать и выделять определенные клеточные линии, которые присутствуют в фолликулах яичников, начиная с ранних антральных стадий, тем самым обеспечивая анализ и культивирование с высоким разрешением. Этот высокоточный подход использует комбинации флуорофорных конъюгированных антител для маркеров клеточной поверхности, которые надежно и специфически экспрессируются среди дискретных гранулезных, стромальных и тека-линий. Начните с помещения яичника в стерильную чашку Петри и залейте ею охлажденную среду, чтобы увлажнить ткань, убедившись, что яичник наполовину погружен в среду.
Удалите все швы или другой материал и рассеките остаточную окружающую ткань от яичника. Чтобы выделить антральные фолликулы, определите отдельные фолликулы и выберите здоровые фолликулы. Исключите любые заполненные кровью, темные или несимметричные фолликулы.
Изолируйте выбранные антральные фолликулы от яичника с помощью скальпелей, сохраняя антральный отдел нетронутым и иссекая корковую ткань, охватывающую фолликул. Поместите каждый иссеченный неповрежденный антральный фолликул в одну лунку из шести лунок. Используя линейку, помещенную под блюдо, определите диаметр фолликула для описательных целей.
Используя скальпель, разделите пополам неповрежденный антральный фолликул, чтобы оценить антральную полость, и добавьте шесть миллилитров ферментативной среды для отсоединения клеток перед инкубацией пластины в увлажненном инкубаторе в течение 10 минут. После инкубации добавляют шесть миллилитров доступной среды, содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки, или FBS, и промывают средой путем повторного энергичного пипетирования над разделенными пополам фолликулами микропипеткой P-1000. Далее собирают среду и пропускают ее через 100-миллиметровый фильтр.
После центрифугирования отфильтрованной надосадочной жидкости при температуре 300 г и четырех градусах Цельсия в течение трех минут перед этим аспирируйте надосадочную жидкость. Поместите оставшуюся ткань в смесь 100 единиц на миллилитр коллагеназы и одну единицу на миллилитр диспазы, разведенную в сбалансированном физиологическом растворе до 30 минут инкубации. Механически разрушают ткани путем растирания и энергичного пипетирования дважды через 10 и 20 минут.
После этого восстановите ткань и промойте с помощью пипетки через наконечник микропипетки P-1000 и процедите через 100-миллилитровый фильтр. Центрифугируйте процеженную ткань при температуре 300 г и четырех градусах Цельсия в течение трех минут, прежде чем положить клеточный гранул, обогащенный тека-клетками и клетками стромы, на лед для маркировки и FACS. Чтобы идентифицировать гранулезные клетки и тека-клетки, ресуспендируют клеточные гранулы в блокирующем растворе, содержащем непосредственно конъюгированные антитела, и инкубируют при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
После промывки и центрифугирования клеток ресуспендируют клетки в буфере FACS, содержащем 4-6 диамидино-2-фенилиндол или DAPI, и пропускают клеточную суспензию через прибор FACS для захвата небольшой популяции клеток, используя флуоресцентную интенсивность флуорофорных конъюгированных антител для стробирования. Оставшуюся часть завязи разделите пополам. Иссекают мозговое вещество с помощью изогнутых тонких ножниц и скальпелей, избегая повреждения коры яичника.
Продолжайте обработку и истончение коры яичников путем осторожного соскабливания до тех пор, пока не останется минимальное мозговое вещество. Разделите кортикальную ткань на полоски шириной две-три миллиметра по длине яичника. Для замораживания ткани яичников поместите одну кортикальную полоску в каждый охлажденный криогенный флакон, содержащий замораживающий раствор.
Встряхните криогенные флаконы, содержащие кортикальные полоски, на вращающейся пластине в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Образование кристаллов льда происходит путем прикосновения к каждому криофлакону ватным наконечником, ненадолго погруженным в жидкий азот. Клетки яичников были собраны, а клеточные фракции были отсортированы из антральных фолликулов FACS до чистоты более 95%.
CD99, специфически меченные гранулезными клетками в PVRL1, или нектине, все больше локализулись в клеточном компартменте oophorus granulosa по мере увеличения антральных фолликулов. Было замечено, что антитела против эндоглина или CD55 специфически разграничивают все клетки стромы и тека, и что аланинаминопептидаза специфически экспрессируется андрогенными тека-клетками. Клетки были помечены антителом, направленным против CD99 для идентификации гранулезных клеток, а антитела против CD45 использовались для исключения гемопоэтических клеток.
Антитела против PVRL1 разделяли популяцию гранулезных клеток на оофоры и компартменты. После ферментативного расщепления с диспазой коллагеназы клеточные препараты, меченные антителами против CD55, CD34 и аланинаминопептидазы, позволили захватить все строма- или тека-клетки или андрогенные тека-клетки с исключением эндотелиальных клеток из популяций тека-клеток. Будьте особенно осторожны, чтобы избежать нарушения антрального отдела фолликулов во время первоначальной изоляции фолликулов, разрезая в пределах безопасного края вокруг границ фолликулов.
После этой процедуры клетки могут быть использованы для молекулярного или диагностического анализа или, альтернативно, культивированы in vitro для токсикологических исследований, экспериментального анализа или рекапитуляции микроокружения фолликула. На сегодняшний день эти методы использовались для моделирования эндокринных нарушений, связанных с яичником, и для выявления новых субпопуляций фолликулоассоциированных клеток.
