Desarrollamos la emulsión Pickering estabilizada con nanopartículas PLGA. La emulsión de Pickering mejoró la afinidad celular con las células de proteínas de antígenos, induciendo una internalización eficiente de antígenos. Las emulsiones de Pickering estabilizadas con nanopartículas fueron fáciles de preparar y administraron antígenos de manera eficiente.
Además, se utilizó un método para monitorear la afinidad de la emulsión a la célula y elaborar la internalización. Este protocolo proporciona información para diseñar formulaciones novedosas con alta eficiencia celular e internalización eficiente de antígenos, que proporcionan una plataforma para el desarrollo de vacunas eficientes. Para comenzar, agregue 100 miligramos de ácido poliláctico-co-glicólico a 10 mililitros de acetona y mezcla de etanol en una proporción de cuatro a uno para servir como la fase de aceite.
Coloque 20 mililitros de solución acuosa de PVA debajo de la campana extractora y revuelva magnéticamente a 400 rotaciones por minuto. Agregue cinco mililitros de la fase de aceite en la solución de PVA gota a gota usando una bomba de jeringa. Luego revuelva la mezcla en la campana extractora hasta que los solventes orgánicos se evaporen por completo.
Después de la volatilización de los disolventes orgánicos, centrifugar la mezcla a 15, 000 G.Lavar tres o más veces hasta que el agua de lavado final sea clara y transparente. Vuelva a suspender las nanopartículas de PLGA lavadas en dos mililitros de agua desionizada y congele la mezcla a 80 grados centígrados durante 24 horas. Para caracterizar el tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas de PLGA, agregue 10 microlitros de nanopartículas de PLGA en un mililitro de agua desionizada para obtener una solución diluyente y transfiera la solución diluyente a una celda DTS1070.
Encienda el ordenador y el analizador dinámico de dispersión de luz. A continuación, coloque la celda DTS1070 en el sistema DLS. Haga clic en el software Zetasizer y cree un nuevo archivo de medición para configurar el procedimiento de determinación.
A continuación, inicie el procedimiento de determinación para obtener el tamaño de partícula y la distribución del potencial zeta. Para preparar nanopartículas de PLGA estabilizadas en emulsión Pickering, o PNPE, agregue nanopartículas de PLGA liofilizadas al agua desionizada a una concentración de cuatro miligramos por mililitro y luego agregue escualano como fase oleosa. Prepare PNPE a través de una sonicación de un solo paso durante cinco minutos a 100 vatios en un sonicador de baño de agua.
Diluir 20 microlitros de PNPE y un mililitro de agua desionizada. Deje caer 20 microlitros de la emulsión en el portaobjetos. Observar la morfología y homogeneidad de la emulsión mediante microscopía óptica a 40 veces el aumento y obtener fotografías.
Encienda el recubridor de centrifugado presionando el botón de encendido. Presione el botón de control y ajuste el tiempo y la velocidad de recubrimiento. Conecte la tubería de nitrógeno a la recubrida de centrifugado y ajuste el fraccionamiento del cilindro de gas a 0,4 kilopascales.
Coloque el chip limpio en la ventosa del recubridor de centrifugado. Agregue 100 microlitros de poli-l-lisina gota a gota al centro del sensor de dióxido de silicio y cierre la cubierta superior del recubridor de centrifugado. Presione el botón de inicio para comenzar a recubrir la muestra y detenga la máquina cuando haya terminado.
Apague la bomba de vacío, apague los botones de encendido y control, y retire el sensor de dióxido de silicio modificado con poli-l-lisina. Para determinar la adhesión de vesículas extracelulares biomiméticas a PNPE, encienda la computadora, la unidad electrónica y la bomba peristáltica, y active el control de temperatura en la parte inferior derecha del software para asegurarse de que la temperatura establecida sea aproximadamente un grado Celsius por debajo de la temperatura ambiente. Coloque los sensores de dióxido de silicio modificados con poli-l-lisina en la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conecte la línea de medición entre la celda de flujo y la bomba de flujo.
Coloque la celda de flujo dentro del sistema de módulos de flujo. Haga clic en la barra de herramientas Adquisición y seleccione Medida de configuración para buscar 1, 3, 5, 7, 9 y 11 octavas del chip en el canal utilizado. Para corregir la línea de base, haga clic en Iniciar medición para permitir que el aire ingrese al módulo de flujo hasta que la línea de base del aire sea suave.
Después de fluir agua desionizada durante 10 a 15 minutos para permitir nuevamente el equilibrio de referencia de la solución, bombee la solución PNPE preparada en el módulo de flujo a una velocidad de flujo de 50 microlitros por minuto para lograr la adsorción de equilibrio en el sensor de dióxido de silicio. Bombee la solución de vesícula extracelular biomimética preparada en el módulo de flujo a una velocidad de flujo de 50 microlitros por minuto para rastrear el proceso de adhesión de bEV a la superficie PNPE. Incubar las células dendríticas de la médula ósea con 1640 medios completos durante siete días y luego sembrarlas en pequeñas placas láser confocales a 1 veces 10 a 6 por pozo durante la noche a 37 grados centígrados y una incubadora de dióxido de carbono al 5%.
Mezclar 0,5 mililitros de ovoalbúmina marcada con cianina 5, con 0,5 mililitros de PNPE durante una hora y eliminar el antígeno fluídico por centrifugación a 5.000 G durante 20 minutos para desarrollar la formulación de la vacuna. Después de la resuspensión con 200 microlitros de agua desionizada, agregue 10 microlitros de la formulación en los pequeños platos láser confocales bajo un banco súper limpio y cocultive con células dendríticas de médula ósea durante seis horas. Después de eliminar el líquido de cultivo de las células, lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato precalentado.
Fijar las células con solución de formaldehído al 4% y PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave las celdas con PBS dos o tres veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una. Permeabilizar las células con 100 microlitros de solución Triton X-100 al 0,5% durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de lavar las células nuevamente con PBS, cubra las celdas en el plato con fondo de vidrio de las pequeñas placas láser confocales con 200 microlitros de solución de trabajo de faloidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar las células con PBS tres veces durante cinco minutos cada una, resienta los núcleos con 200 microlitros de solución DAPI durante unos 30 segundos. Para el análisis de imágenes, encienda el hardware del microscopio confocal en secuencia, incluido el láser, el confocal, el microscopio y la computadora.
Haga clic en el software y seleccione Nikon Confocal para entrar en el sistema de pruebas. En el sistema de microscopio confocal, encienda las distintas unidades en el orden indicado. Primero, configure los canales FITC, DAPI y Cy5 y ajuste el HV y el offset correspondientes.
Luego, después de seleccionar la lente 100 veces de aceite y poner una gota de aceite de cedro en la parte superior, coloque los pequeños platos láser confocales que contienen células dendríticas de médula ósea teñidas en la etapa del microscopio. Haga clic en el botón escanear. Bajo el microscopio de fluorescencia, localice las células de interés moviendo el eje x, el eje y y el eje z.
Sintoniza la intensidad del láser, el tamaño de la imagen y otros parámetros para permitir el escaneo de imágenes confocales de alta calidad. Finalmente, haga clic en el botón Capturar y guarde las imágenes. La adhesión de vesículas extracelulares biomiméticas a PNPE se rastreó utilizando QCM-D.
Una disminución inmediata en la frecuencia, indicó una rápida adhesión de vesículas extracelulares biomiméticas a PNPE después del encuentro. Además, delta F disminuyó con el aumento de la concentración de vesículas extracelulares biomiméticas, lo que refleja un efecto dependiente de la concentración. Las micropartículas de PLGA y la nanoemulsión estabilizada con surfactante se unieron débilmente a vesículas extracelulares biomiméticas, incluso a una alta concentración de 80 microgramos por mililitro, lo que probablemente resultó de la falta de sitios de contacto con las células inmunes.
La señal fluorescente de cianina-5 ovoalbúmina indicó que la cantidad total de antígeno internalizado en las células es significativamente mayor en el grupo tratado con PNPE en comparación con el grupo tratado con micropartículas PLGA y nanoemulsión estabilizada con surfactante. El análisis cuantitativo de la captación celular mostró una intensidad relativa significativamente mayor de fluorescencia y células dendríticas de médula ósea tratadas con PNPE que en aquellas tratadas con micropartículas de PLGA y nanoemulsión estabilizada con surfactante. Los resultados obtenidos demostraron que el PNPE promovió la internalización del antígeno y administró eficazmente el antígeno intracelularmente.
Para obtener una emulsión homogénea, la mezcla debe agitarse continuamente durante la sonicación.
