Nous avons développé l’émulsion de Pickering stabilisée par nanoparticules PLGA. L’émulsion de Pickering a amélioré l’affinité cellulaire avec les cellules protéiques de l’antigène, induisant une internalisation efficace des antigènes. Les émulsions de Pickering stabilisées aux nanoparticules étaient faciles à préparer et délivraient efficacement l’antigène.
De plus, une méthode a été utilisée pour surveiller l’affinité de l’émulsion avec la cellule et élaborer sur l’internalisation. Ce protocole fournit des informations pour la conception de nouvelles formulations à haute efficacité cellulaire et à internalisation efficace des antigènes, qui fournissent une plate-forme pour le développement de vaccins efficaces. Pour commencer, ajoutez 100 milligrammes d’acide polylactique-co-glycolique à 10 millilitres de mélange d’acétone et d’éthanol dans un rapport de quatre à un pour servir de phase huileuse.
Placez 20 millilitres de solution aqueuse de PVA sous la hotte et agitez magnétiquement à 400 rotations par minute. Ajouter cinq millilitres de phase huileuse dans la solution PVA goutte à goutte à l’aide d’une pompe à seringue. Ensuite, agiter le mélange dans la hotte jusqu’à ce que les solvants organiques s’évaporent complètement.
Après la volatilisation des solvants organiques, centrifuger le mélange à 15 000 G.Laver trois fois ou plus jusqu’à ce que l’eau de lavage finale soit claire et transparente. Re-suspendre les nanoparticules PLGA lavées dans deux millilitres d’eau désionisée et congeler le mélange à 80 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour caractériser la taille et le potentiel zêta des nanoparticules PLGA, ajoutez 10 microlitres de nanoparticules PLGA dans un millilitre d’eau désionisée pour obtenir une solution de diluant et transférer la solution de diluant dans une cellule DTS1070.
Allumez l’ordinateur et l’analyseur dynamique de diffusion de la lumière. Placez ensuite la cellule DTS1070 dans le système DLS. Cliquez sur le logiciel Zetasizer et créez un nouveau fichier de mesure pour configurer la procédure de détermination.
Lancez ensuite la procédure de détermination pour obtenir la taille des particules et la distribution du potentiel zêta. Pour préparer des nanoparticules de PLGA en émulsion de Pickering stabilisée, ou PNPE, ajoutez des nanoparticules de PLGA lyophilisées à de l’eau désionisée à une concentration de quatre milligrammes par millilitre, puis ajoutez du squalane en phase huileuse. Préparez PNPE par sonication en une étape pendant cinq minutes à 100 watts dans un sonicateur au bain-marie.
Diluer 20 microlitres de PNPE et un millilitre d’eau désionisée. Déposez 20 microlitres de l’émulsion sur la lame. Observer la morphologie et l’homogénéité de l’émulsion en utilisant la microscopie optique à 40 fois le grossissement et obtenir des photographies.
Allumez l’enrobage en appuyant sur le bouton d’alimentation. Appuyez sur le bouton de commande et réglez le temps et la vitesse du revêtement. Connectez le tuyau d’azote à l’enrobage et ajustez le fractionnement de la bouteille de gaz à 0,4 kilopascals.
Placez la puce propre sur la ventouse de la bobine de spin. Ajoutez 100 microlitres de poly-l-lysine goutte à goutte au centre du capteur de dioxyde de silicium et fermez le couvercle supérieur de la couche de spin. Appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer à enduire l’échantillon et arrêter la machine lorsque vous avez terminé.
Éteignez la pompe à vide, éteignez les boutons d’alimentation et de commande et retirez le capteur de dioxyde de silicium modifié par poly-l-lysine. Pour déterminer l’adhésion des vésicules extracellulaires biomimétiques à la PNPE, allumez l’ordinateur, l’unité électronique et la pompe péristaltique, et activez le contrôle de la température en bas à droite dans le logiciel pour vous assurer que la température réglée est inférieure d’environ un degré Celsius à la température ambiante. Placez les capteurs de dioxyde de silicium modifiés par poly-l-lysine dans la cellule d’écoulement conformément aux instructions d’utilisation et connectez la ligne de mesure entre la cellule de débit et la pompe de débit.
Placez la cellule d’écoulement à l’intérieur du système de module d’écoulement. Cliquez sur la barre d’outils Acquisition et sélectionnez Configurer la mesure pour rechercher 1, 3, 5, 7, 9 et 11 octaves de la puce dans le canal utilisé. Pour corriger la ligne de base, cliquez sur Démarrer la mesure pour permettre à l’air d’entrer dans le module de débit jusqu’à ce que la ligne de base de l’air soit lisse.
Après avoir fait couler de l’eau désionisée pendant 10 à 15 minutes pour permettre à nouveau l’équilibre de base de la solution, pompez la solution PNPE préparée dans le module d’écoulement à un débit de 50 microlitres par minute pour obtenir une adsorption d’équilibre sur le capteur de dioxyde de silicium. Pomper la solution de vésicule extracellulaire biomimétique préparée dans le module d’écoulement à un débit de 50 microlitres par minute pour suivre le processus d’adhésion du bEV à la surface du PNPE. Incuber les cellules dendritiques de la moelle osseuse avec 1640 milieux complets pendant sept jours, puis les ensemencer dans de petites boîtes confocales au laser à 1 fois 10 à 6 par puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius et un incubateur de dioxyde de carbone à 5%.
Mélanger 0,5 millilitre d’ovalbumine marquée cyanine 5, avec 0,5 millilitre de PNPE pendant une heure et éliminer l’antigène fluidique par centrifugation à 5 000 g pendant 20 minutes pour développer une formulation vaccinale. Après une remise en suspension avec 200 microlitres d’eau désionisée, ajoutez 10 microlitres de la formulation dans les petites boîtes confocales laser sous un banc super propre et co-culture avec des cellules dendritiques de moelle osseuse pendant six heures. Après avoir retiré le liquide de culture des cellules, lavez-les deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate préchauffée.
Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde à 4% et du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les cellules avec du PBS deux ou trois fois à température ambiante pendant 10 minutes chacune. Perméabiliser les cellules avec 100 microlitres de solution de Triton X-100 à 0,5% pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir lavé à nouveau les cellules avec du PBS, couvrir les cellules sur le plat inférieur en verre des petites antennes confocales au laser avec 200 microlitres de solution de travail de phalloïdine conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine et incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir lavé les cellules avec du PBS trois fois pendant cinq minutes chacune, recolorez les noyaux avec 200 microlitres de solution DAPI pendant environ 30 secondes. Pour l’analyse d’image, allumez le matériel de microscope confocal en séquence, y compris le laser, le microscope confocale, le microscope et l’ordinateur.
Cliquez sur le logiciel et sélectionnez Nikon Confocal pour accéder au système de test. Dans le système de microscope confocal, allumez les différentes unités dans l’ordre indiqué. Tout d’abord, configurez les canaux FITC, DAPI et Cy5 et ajustez le HV et le décalage correspondants.
Ensuite, après avoir sélectionné la lentille d’huile 100 fois et mis une goutte d’huile de cèdre sur le dessus, placez les petites antennes confocales laser contenant des cellules dendritiques colorées de la moelle osseuse sur la scène du microscope. Cliquez sur le bouton d’analyse. Au microscope à fluorescence, localiser les cellules d’intérêt en déplaçant les axes x, y et z.
Réglez l’intensité du laser, la taille de l’image et d’autres paramètres pour permettre la numérisation d’images confocales de haute qualité. Enfin, cliquez sur le bouton Capturer et enregistrez les images. L’adhésion des vésicules extracellulaires biomimétiques à la PNPE a été suivie à l’aide de QCM-D.
Une diminution immédiate de la fréquence a indiqué une adhésion rapide des vésicules extracellulaires biomimétiques à la PNPE après la rencontre. De plus, le delta F diminuait avec l’augmentation de la concentration de vésicules extracellulaires biomimétiques, reflétant un effet dépendant de la concentration. Les microparticules PLGA et la nano-émulsion stabilisée par surfactant étaient faiblement liées aux vésicules extracellulaires biomimétiques, même à une concentration élevée de 80 microgrammes par millilitre, ce qui résultait probablement d’un manque de sites de contact avec les cellules immunitaires.
Le signal fluorescent de l’ovalbumine cyanine-5 a indiqué que la quantité totale d’antigène internalisée dans les cellules est significativement plus élevée dans le groupe traité par PNPE que dans le groupe traité par microparticules PLGA et nano-émulsion stabilisée par surfactant. L’analyse quantitative de l’absorption cellulaire a montré une intensité relative significativement plus élevée de fluorescence et de cellules dendritiques de moelle osseuse traitées avec PNPE que chez celles traitées avec des microparticules PLGA et une nano-émulsion stabilisée par surfactant. Les résultats obtenus ont démontré que la PNPE favorisait l’internalisation de l’antigène et délivrait efficacement l’antigène par voie intracellulaire.
Afin d’obtenir une émulsion homogène, le mélange doit être continuellement agité pendant la sonication.
