Desenvolvemos a emulsão de Pickering estabilizada de nanopartículas PLGA. A emulsão de Pickering melhorou a afinidade celular com as células proteicas do antígeno, induzindo a internalização eficiente dos antígenos. As emulsões de Pickering estabilizadas com nanopartículas foram fáceis de preparar e fornecer antígeno de forma eficiente.
Além disso, um método foi utilizado para monitorar a afinidade da emulsão à célula e elaborar a internalização. Este protocolo fornece insights para o projeto de novas formulações com alta eficiência celular e internalização eficiente de antígenos, que fornecem uma plataforma para o desenvolvimento de vacinas eficientes. Para começar, adicione 100 miligramas de ácido polilático-co-glicólico a 10 mililitros de mistura de acetona e etanol em uma proporção de quatro para um para servir como a fase oleosa.
Colocar 20 mililitros de solução aquosa de PVA sob o exaustor e agitar magneticamente a 400 rotações por minuto. Adicione cinco mililitros da fase de óleo na solução de PVA gota a gota usando uma bomba de seringa. Em seguida, mexa a mistura no exaustor até que os solventes orgânicos evaporem completamente.
Após a volatilização dos solventes orgânicos, centrifugar a mistura a 15 000 G.Lavar três ou mais vezes até que a água de lavagem final esteja límpida e transparente. Ressuspeite as nanopartículas PLGA lavadas em dois mililitros de água deionizada e congele a mistura a 80 graus Celsius por 24 horas. Para caracterizar o tamanho e o potencial zeta das nanopartículas PLGA, adicionar 10 microlitros de nanopartículas PLGA em um mililitro de água deionizada para obter uma solução diluente e transferir a solução diluente para uma célula DTS1070.
Ligue o computador e o analisador dinâmico de dispersão de luz. Em seguida, coloque a célula DTS1070 no sistema DLS. Clique no software Zetasizer e crie um novo arquivo de medição para configurar o procedimento de determinação.
Em seguida, inicie o procedimento de determinação para obter o tamanho das partículas e a distribuição do potencial zeta. Para preparar nanopartículas PLGA estabilizadas emulsão de Pickering, ou PNPE, adicione nanopartículas PLGA liofilizadas à água desionizada a uma concentração de quatro miligramas por mililitro e, em seguida, adicione esqualano como a fase de óleo. Prepare o PNPE via sonicação de uma etapa por cinco minutos a 100 watts em um sonicator de banho de água.
Diluir 20 microlitros de PNPE e um mililitro de água deionizada. Solte 20 microlitros da emulsão na lâmina. Observar a morfologia e homogeneidade da emulsão utilizando microscopia óptica com ampliação de 40 vezes e obter fotografias.
Ligue o revestidor giratório pressionando o botão liga/desliga. Pressione o botão de controle e defina o tempo e a velocidade do revestimento. Conecte o tubo de nitrogênio ao revestidor de spin e ajuste o fracionamento do cilindro de gás para 0,4 kilopascals.
Coloque o chip limpo na ventosa do revestidor de fiação. Adicione 100 microlitros de poli-l-lisina gota a gota ao centro do sensor de dióxido de silício e feche a tampa superior do revestidor de spin. Pressione o botão de início para começar a revestir a amostra e parar a máquina quando terminar.
Desligue a bomba de vácuo, desligue os botões de alimentação e controle e remova o sensor de dióxido de silício modificado com poli-l-lisina. Para determinar a adesão de vesículas extracelulares biomiméticas ao PNPE, ligue o computador, a unidade eletrônica e a bomba peristáltica e ative o controle de temperatura no canto inferior direito do software para garantir que a temperatura definida esteja aproximadamente um grau Celsius abaixo da temperatura ambiente. Coloque os sensores de dióxido de silício modificado com poli-l-lisina na célula de fluxo de acordo com as instruções de operação e conecte a linha de medição entre a célula de fluxo e a bomba de fluxo.
Coloque a célula de fluxo dentro do sistema do módulo de fluxo. Clique na barra de ferramentas Aquisição e selecione Medição de configuração para procurar 1, 3, 5, 7, 9 e 11 oitavas do chip no canal usado. Para corrigir a linha de base, clique em Iniciar Medição para permitir que o ar entre no módulo de fluxo até que a linha de base do ar esteja lisa.
Depois de fluir água deionizada por 10 a 15 minutos para permitir o equilíbrio de linha de base da solução novamente, bombeie a solução PNPE preparada para o módulo de fluxo a uma taxa de fluxo de 50 microlitros por minuto para alcançar a adsorção de equilíbrio no sensor de dióxido de silício. Bombear a solução de vesícula extracelular biomimética preparada para o módulo de fluxo a uma taxa de fluxo de 50 microlitros por minuto para rastrear o processo de adesão do bEV à superfície do PNPE. Incubar as células dendríticas da medula óssea com 1640 meios completos durante sete dias e, em seguida, semeá-las em pequenas placas de laser confocais a 1 vezes 10 a 6 por poço durante a noite a 37 graus Celsius e uma incubadora de dióxido de carbono a 5%.
Misture 0,5 mililitros de ovalbumina marcada com cianina 5, com 0,5 mililitros de PNPE por uma hora e remova o antígeno fluídico por centrifugação a 5.000 G por 20 minutos para desenvolver a formulação da vacina. Após a re-suspensão com 200 microlitros de água deionizada, adicione 10 microlitros da formulação nas pequenas placas a laser confocais sob um banco super limpo e co-cultura com células dendríticas da medula óssea por seis horas. Depois de remover o fluido de cultura das células, lave-as duas vezes com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido.
Fixar as células com solução de formaldeído a 4% e PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lave as células com PBS duas ou três vezes à temperatura ambiente durante 10 minutos cada. Permeabilizar as células com 100 microlitros de solução de 0,5% de Triton X-100 por cinco minutos à temperatura ambiente.
Depois de lavar as células novamente com PBS, cubra as células no prato de fundo de vidro das pequenas placas de laser confocais com 200 microlitros de solução de trabalho de faloidina conjugada com isotiocianato de fluoresceína e incube por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após lavar as células com PBS três vezes por cinco minutos cada, restain os núcleos com 200 microlitros de solução de DAPI por cerca de 30 segundos. Para análise de imagem, ligue o hardware do microscópio confocal em sequência, incluindo o laser, o confocal, o microscópio e o computador.
Clique no software e selecione Nikon Confocal para entrar no sistema de teste. No sistema de microscópio confocal, ligue as várias unidades na ordem indicada. Primeiro, configure os canais FITC, DAPI e Cy5 e ajuste o HV e o deslocamento correspondentes.
Em seguida, depois de selecionar a lente de óleo 100 vezes e colocar uma gota de óleo de cedro no topo, coloque os pequenos pratos a laser confocais contendo células dendríticas da medula óssea coradas no estágio do microscópio. Clique no botão de digitalização. Sob microscópio de fluorescência, localize as células de interesse movendo o eixo x, o eixo y e o eixo z.
Ajuste a intensidade do laser, o tamanho da imagem e outros parâmetros para permitir a digitalização de imagens confocais de alta qualidade. Finalmente, clique no botão Capturar e salve as imagens. A adesão de vesículas extracelulares biomiméticas à EPNP foi rastreada por meio do QCM-D.
Uma diminuição imediata da frequência, indicou uma rápida adesão de vesículas extracelulares biomiméticas ao PNPE após o encontro. Além disso, o delta F diminuiu com o aumento da concentração de vesículas extracelulares biomiméticas, refletindo um efeito dependente da concentração. As micropartículas PLGA e a nanoemulsão estabilizada por surfactante foram fracamente ligadas a vesículas extracelulares biomiméticas, mesmo em alta concentração de 80 microgramas por mililitro, o que provavelmente resultou da falta de locais de contato com as células imunes.
O sinal fluorescente de ovalbumina cianina-5 indicou que a quantidade total de antígeno internalizado nas células é significativamente maior no grupo tratado com PNPE em comparação com o grupo tratado com micropartículas PLGA e nanoemulsão estabilizada com surfactante. A análise quantitativa da captação celular mostrou uma intensidade relativa significativamente maior de fluorescência e células dendríticas da medula óssea tratadas com PNPE do que naquelas tratadas com micropartículas PLGA e nanoemulsão estabilizada com surfactante. Os resultados obtidos demonstraram que o PNPE promoveu a internalização do antígeno e efetivamente entregou o antígeno intracelularmente.
A fim de obter emulsão homogênea, a mistura deve ser continuamente agitada durante a sonicação.
