우리는 PLGA 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼을 개발했습니다. 피커링 에멀젼은 항원 단백질 세포에 대한 세포 친화력을 향상시켜 항원의 효율적인 내재화를 유도했습니다. 나노입자 안정화된 피커링 에멀젼은 항원을 효율적으로 제조하고 전달하기 쉬웠다.
추가적으로, 세포에 대한 에멀젼의 친화도를 모니터링하고 내재화에 대해 정교화하기 위한 방법을 사용하였다. 이 프로토콜은 효율적인 백신 개발을 위한 플랫폼을 제공하는 높은 세포 효율과 효율적인 항원 내재화를 갖춘 새로운 제형을 설계하기 위한 통찰력을 제공합니다. 시작하려면 100 밀리그램의 폴리 락틱 - 코 - 글리콜 산을 10 밀리리터의 아세톤과 에탄올 혼합물에 4 대 1의 비율로 첨가하여 오일 상 역할을합니다.
흄 후드 아래에 PVA 수용액 20ml를 놓고 분당 400회전으로 자기적으로 저어줍니다. 주사기 펌프를 사용하여 5 밀리리터의 오일 상을 PVA 용액에 한 방울 씩 첨가하십시오. 그런 다음 유기 용제가 완전히 증발 할 때까지 흄 후드에서 혼합물을 저어줍니다.
유기 용제를 휘발 한 후 혼합물을 15, 000 G에서 원심 분리하여 최종 세척수가 깨끗하고 투명해질 때까지 3 회 이상 세척하십시오. 세척된 PLGA 나노입자를 2밀리리터의 탈이온수에 재현탁시키고, 혼합물을 섭씨 80도에서 24시간 동안 동결시킨다. PLGA 나노입자의 크기 및 제타 전위를 특성화하기 위해, 10 마이크로리터의 PLGA 나노입자를 1밀리리터의 탈이온수에 첨가하여 희석제 용액을 수득하고 희석제 용액을 DTS1070 셀로 옮긴다.
컴퓨터와 동적 광산란 분석기를 켭니다. 그런 다음 DTS1070 셀을 DLS 시스템에 배치합니다. Zetasizer 소프트웨어를 클릭하고 새 측정 파일을 생성하여 측정 절차를 설정합니다.
그런 다음 입자 크기와 제타 전위 분포를 얻기 위해 결정 절차를 시작하십시오. PLGA 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼 또는 PNPE를 준비하려면 동결 건조 된 PLGA 나노 입자를 밀리리터 당 4 밀리그램 농도의 탈 이온수에 첨가 한 다음 스쿠알란을 오일 상으로 첨가하십시오. 수조 초음파 처리기에서 100 와트에서 5 분 동안 원스텝 초음파 처리를 통해 PNPE를 준비하십시오.
20 마이크로 리터의 PNPE와 1 밀리리터의 탈 이온수를 희석하십시오. 슬라이드에 20 마이크로 리터의 에멀젼을 떨어 뜨립니다. 광학 현미경을 이용하여 에멀젼의 형태와 균질성을 40배 배율로 관찰하고 사진을 얻었다.
전원 버튼을 눌러 스핀 코터를 켭니다. 제어 버튼을 누르고 코팅 시간과 속도를 설정하십시오. 질소 파이프를 스핀 코터에 연결하고 가스 실린더의 분획을 0.4 킬로파스칼로 조정하십시오.
깨끗한 칩을 스핀 코터의 흡입 컵에 놓습니다. 100마이크로리터의 폴리-l-라이신을 이산화규소 센서의 중앙에 적가하고 스핀 코터의 상단 덮개를 닫습니다. 시작 버튼을 눌러 샘플 코팅을 시작하고 완료되면 기계를 중지합니다.
진공 펌프를 끄고 전원 및 제어 버튼을 끄고 poly-l- 라이신 변성 이산화 규소 센서를 제거하십시오. 생체 모방 세포 외 소포가 PNPE에 부착되는지 확인하려면 컴퓨터, 전자 장치 및 연동 펌프를 켜고 소프트웨어의 오른쪽 하단에있는 온도 제어를 활성화하여 설정 온도가 실온보다 섭씨 약 1도 낮도록합니다. 작동 지침에 따라 poly-l-lysine 변성 이산화규소 센서를 플로우 셀에 놓고 플로우 셀과 플로우 펌프 사이에 측정 라인을 연결합니다.
플로우 모듈 시스템 내부에 플로우 셀을 배치합니다. 획득 도구 모음을 클릭하고 측정 설정을 선택하여 사용된 채널에서 칩의 1, 3, 5, 7, 9 및 11 옥타브를 검색합니다. 기준선을 수정하려면 측정 시작을 클릭하여 공기 기준선이 부드러워질 때까지 공기가 흐름 모듈로 들어갈 수 있도록 합니다.
용액 기준선 평형을 다시 활성화하기 위해 10-15분 동안 탈이온수를 흘린 후, 준비된 PNPE 용액을 분당 50마이크로리터의 유속으로 유동 모듈로 펌핑하여 이산화규소 센서에서 평형 흡착을 달성합니다. 준비된 생체모방 세포외 소포 용액을 분당 50마이크로리터의 유속으로 유동 모듈에 펌핑하여 PNPE 표면에 대한 bEV 부착 과정을 추적합니다. 골수 수지상 세포를 1640개의 완전한 배지로 7일 동안 배양한 다음 섭씨 37도 및 5%이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 우물당 1회 10에서 6회씩 작은 공초점 레이저 접시에 씨를 뿌립니다.
시아닌 5 표지 된 오발 부민 0.5 밀리리터와 PNPE 0.5 밀리리터를 1 시간 동안 혼합하고 5, 000 G에서 20 분 동안 원심 분리하여 유체 항원을 제거하여 백신 제형을 개발한다. 200마이크로리터의 탈이온수로 재현탁한 후, 10마이크로리터의 제형을 슈퍼 클린 벤치 아래의 작은 컨포칼 레이저 접시에 넣고 6시간 동안 골수 수지상 세포와 공동 배양합니다. 세포에서 배양액을 제거한 후 예열 된 인산염 완충 식염수로 두 번 세척하십시오.
실온에서 10 분 동안 4 % 포름 알데히드 용액과 PBS로 세포를 고정합니다. 세포를 PBS로 실온에서 각각 10분 동안 2회 또는 3회 세척한다. 실온에서 5 분 동안 100 마이크로 리터의 0.5 % Triton X-100 용액으로 세포를 투과시킵니다.
세포를 PBS로 다시 세척한 후, 200 마이크로리터의 플루오레세인 이소티오시아네이트 공액 팔로이딘 작업 용액으로 작은 공초점 레이저 접시의 유리 바닥 접시에 세포를 덮고 암실에서 실온에서 30분 동안 배양한다. 세포를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한 후, 약 30초 동안 200마이크로리터의 DAPI 용액으로 핵을 염색한다. 이미지 분석을 위해 레이저, 공초점, 현미경 및 컴퓨터를 포함한 컨포칼 현미경 하드웨어를 순서대로 켭니다.
소프트웨어를 클릭하고 Nikon Confocal 을 선택하여 테스트 시스템으로 들어갑니다. 컨포칼 현미경 시스템에서 다양한 장치를 표시된 순서대로 켭니다. 먼저 FITC, DAPI 및 Cy5 채널을 설정하고 해당 HV 및 오프셋을 조정합니다.
그 다음 100배 오일 렌즈를 선택하고 그 위에 삼나무 오일 한 방울을 놓고 염색된 골수 수지상 세포가 들어 있는 작은 공초점 레이저 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 스캔 버튼을 클릭합니다. 형광 현미경에서 x축, y축 및 z축을 이동하여 관심 있는 세포를 찾습니다.
레이저 강도, 이미지 크기 및 기타 매개 변수를 조정하여 고품질 공초점 이미지를 스캔할 수 있습니다. 마지막으로 캡처 버튼을 누르고 이미지를 저장합니다. PNPE에 대한 생체모방성 세포외 소포의 부착을 QCM-D를 사용하여 추적하였다.
빈도의 즉각적인 감소는 만남 후 생체 모방 세포 외 소포가 PNPE에 빠르게 부착되었음을 나타냅니다. 또한, 델타 F는 생체 모방 세포 외 소포 농도가 증가함에 따라 감소하여 농도 의존적 효과를 반영합니다. PLGA 마이크로 입자 및 계면 활성제 안정화 나노 에멀젼은 밀리리터 당 80 마이크로 그램의 고농도에서도 생체 모방 세포 외 소포에 약하게 결합되었으며, 이는 아마도 면역 세포와의 접촉 부위가 부족하여 발생했을 것입니다.
시아닌-5 오브알부민 형광 신호는 세포 내로 내재화된 항원의 총량이 PLGA 마이크로입자 및 계면활성제-안정화 나노에멀젼 처리군에 비해 PNPE 처리군에서 유의하게 더 높다는 것을 나타내었다. 세포 흡수의 정량 분석은 PLGA 미세입자 및 계면활성제-안정화 나노에멀젼으로 처리된 세포보다 PNPE로 처리된 형광 및 골수 수지상 세포의 상대적 강도가 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 얻어진 결과는 PNPE가 항원 내재화를 촉진하고 항원을 세포 내로 효과적으로 전달한다는 것을 입증했습니다.
균질 한 에멀젼을 얻기 위해서는 초음파 처리 중에 혼합물을 지속적으로 흔들어야합니다.
