PLGA nanopartiküllerini stabilize edilmiş Pickering emülsiyonunu geliştirdik. Pickering emülsiyonu, antijen protein hücrelerine hücresel afiniteyi geliştirerek antijenlerin etkili bir şekilde içselleştirilmesini sağladı. Nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonlarının hazırlanması ve antijenin verimli bir şekilde verilmesi kolaydı.
Ek olarak, emülsiyonun hücreye afinitesini izlemek ve içselleştirmeyi detaylandırmak için bir yöntem kullanılmıştır. Bu protokol, etkili aşıların geliştirilmesi için bir platform sağlayan yüksek hücre verimliliği ve etkili antijen içselleştirme ile yeni formülasyonlar tasarlamak için içgörüler sağlar. Başlamak için, yağ fazı olarak hizmet etmek üzere 10 mililitre aseton ve etanol karışımına 100 miligram polilaktik-ko-glikolik asit ekleyin.
Duman davlumbazının altına 20 mililitre PVA sulu çözelti yerleştirin ve dakikada 400 dönüşte manyetik olarak karıştırın. Bir şırınga pompası kullanarak PVA çözeltisine damla damla beş mililitre yağ fazı ekleyin. Daha sonra karışımı duman davlumbazında organik çözücüler tamamen buharlaşana kadar karıştırın.
Organik çözücülerin uçuculaşmasından sonra, karışımı 15.000 G.'de santrifüj edin.Son yıkama suyu berrak ve şeffaf olana kadar üç veya daha fazla kez yıkayın. Yıkanmış PLGA nanopartiküllerini iki mililitre deiyonize suda tekrar askıya alın ve karışımı 24 saat boyunca 80 santigrat derecede dondurun. PLGA nanopartiküllerinin boyutunu ve zeta potansiyelini karakterize etmek için, seyreltici bir çözelti elde etmek ve seyreltici çözeltiyi bir DTS1070 hücresine aktarmak için bir mililitre deiyonize suya 10 mikrolitre PLGA nanopartikülleri ekleyin.
Bilgisayarı ve dinamik ışık saçılma analizörünü açın. Ardından DTS1070 hücresini DLS sistemine yerleştirin. Zetasizer yazılımına tıklayın ve belirleme prosedürünü ayarlamak için yeni bir ölçüm dosyası oluşturun.
Daha sonra partikül boyutunu ve zeta potansiyel dağılımını elde etmek için belirleme prosedürünü başlatın. PLGA nanopartikülleri stabilize Pickering emülsiyonu veya PNPE hazırlamak için, dondurularak kurutulmuş PLGA nanopartiküllerini mililitre başına dört miligram konsantrasyonda deiyonize suya ekleyin ve ardından yağ fazı olarak skualen ekleyin. PNPE'yi bir su banyosu sonikatöründe 100 watt'ta beş dakika boyunca tek adımlı sonikasyon yoluyla hazırlayın.
20 mikrolitre PNPE ve bir mililitre deiyonize suyu seyreltin. Slayta 20 mikrolitre emülsiyon bırakın. Optik mikroskopi kullanarak emülsiyonun morfolojisini ve homojenliğini 40 kat büyütmede gözlemleyin ve fotoğraflar elde edin.
Güç düğmesine basarak döndürme kaplayıcısını açın. Kontrol düğmesine basın ve kaplama süresini ve hızını ayarlayın. Azot borusunu spin kaplayıcıya bağlayın ve gaz silindirinin fraksiyonasyonunu 0,4 kilopaskal'a ayarlayın.
Temiz çipi spin kaplayıcının vantuzuna yerleştirin. Silikon dioksit sensörünün merkezine damla damla 100 mikrolitre poli-l-lizin ekleyin ve spin kaplayıcının üst kapağını kapatın. Numuneyi kaplamaya başlamak ve bittiğinde makineyi durdurmak için başlat düğmesine basın.
Vakum pompasını kapatın, güç ve kontrol düğmelerini kapatın ve poli-l-lizin modifiye silikon dioksit sensörünü çıkarın. Biyomimetik hücre dışı veziküllerin PNPE'ye yapışmasını belirlemek için bilgisayarı, elektronik üniteyi ve peristaltik pompayı açın ve ayarlanan sıcaklığın oda sıcaklığının yaklaşık bir santigrat derece altında olmasını sağlamak için yazılımda sağ alttaki sıcaklık kontrolünü etkinleştirin. Poli-l-lizin modifiye silikon dioksit sensörlerini çalışma talimatlarına göre akış hücresine yerleştirin ve ölçüm hattını akış hücresi ile akış pompası arasına bağlayın.
Akış hücresini akış modülü sisteminin içine yerleştirin. Edinme araç çubuğuna tıklayın ve kullanılan kanalda çipin 1, 3, 5, 7, 9 ve 11 oktavını aramak için Kurulum Ölçümü'nü seçin. Taban çizgisini düzeltmek için, hava taban çizgisi pürüzsüz olana kadar havanın akış modülüne girmesine izin vermek için Ölçümü Başlat'a tıklayın.
Çözelti temel dengesini tekrar sağlamak için deiyonize suyu 10 ila 15 dakika boyunca akıttıktan sonra, silikon dioksit sensörü üzerinde denge adsorpsiyonu elde etmek için hazırlanan PNPE çözeltisini dakikada 50 mikrolitre akış hızında akış modülüne pompalayın. PNPE yüzeyine bEV yapışma sürecini izlemek için hazırlanan biyomimetik hücre dışı vezikül çözeltisini dakikada 50 mikrolitre akış hızında akış modülüne pompalayın. Kemik iliği dendritik hücrelerini yedi gün boyunca 1640 tam ortam ile inkübe edin ve daha sonra bunları 37 santigrat derecede ve % 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe gece boyunca kuyu başına 10 ila 6 oranında küçük konfokal lazer kaplarına tohumlayın.
0.5 mililitre siyanin 5 etiketli ovalbümin, bir saat boyunca 0.5 mililitre PNPE ile karıştırın ve aşı formülasyonu geliştirmek için 20 dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleme ile akışkan antijeni çıkarın. 200 mikrolitre deiyonize su ile yeniden süspansiyondan sonra, altı saat boyunca kemik iliği dendritik hücrelerle süper temiz bir tezgah ve ortak kültür altındaki küçük konfokal lazer kaplarına 10 mikrolitre formülasyon ekleyin. Kültür sıvısını hücrelerden çıkardıktan sonra, önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkayın.
Hücreleri% 4 formaldehit çözeltisi ve PBS ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Hücreleri PBS ile oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca iki veya üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 mikrolitre% 0.5 Triton X-100 çözeltisi ile geçirgenleştirin.
Hücreleri PBS ile tekrar yıkadıktan sonra, küçük konfokal lazer kaplarının cam alt kabındaki hücreleri 200 mikrolitre floresein izotiyosiyanat konjuge falloidin çalışma çözeltisi ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, çekirdekleri yaklaşık 30 saniye boyunca 200 mikrolitre DAPI çözeltisi ile yeniden tutun. Görüntü analizi için, lazer, konfokal, mikroskop ve bilgisayar dahil olmak üzere konfokal mikroskop donanımını sırayla açın.
Yazılımı tıklatın ve test sistemine girmek için Nikon Confocal öğesini seçin. Konfokal mikroskop sisteminde, çeşitli birimleri belirtilen sırayla açın. İlk olarak, FITC, DAPI ve Cy5 kanallarını kurun ve ilgili YG ve ofseti ayarlayın.
Daha sonra 100 kez yağ lensini seçtikten ve mikroskop aşamasında lekeli kemik iliği dendritik hücreleri içeren küçük konfokal lazer kaplarını en üste bir damla sedir yağı koyduktan sonra. Tara düğmesini tıklatın. Floresan mikroskobu altında, x eksenini, y eksenini ve z eksenini hareket ettirerek ilgilenilen hücreleri bulun.
Yüksek kaliteli konfokal görüntülerin taranmasını sağlamak için lazer yoğunluğunu, görüntü boyutunu ve diğer parametreleri ayarlayın. Son olarak, tıklayın Yakala düğmesine basın ve görüntüleri kaydedin. Biyomimetik hücre dışı veziküllerin PNPE'ye yapışması QCM-D kullanılarak izlendi.
Frekansta ani bir azalma, karşılaşmadan sonra biyomimetik hücre dışı veziküllerin PNPE'ye hızlı bir şekilde yapıştığını gösterdi. Dahası, delta F, konsantrasyona bağımlı bir etkiyi yansıtan biyomimetik hücre dışı vezikül konsantrasyonunun artmasıyla azalmıştır. PLGA mikropartikülleri ve yüzey aktif madde stabilize nano emülsiyonu, mililitre başına 80 mikrogramlık yüksek konsantrasyonda bile, muhtemelen bağışıklık hücreleri ile temas bölgelerinin eksikliğinden kaynaklanan biyomimetik hücre dışı veziküllere zayıf bir şekilde bağlanmıştır.
Siyanin-5 ovalbümin floresan sinyali, PNPE ile muamele edilen grupta, PLGA mikropartikülleri ve yüzey aktif madde stabilize nano emülsiyonla muamele edilen gruba kıyasla hücrelere içselleştirilen toplam antijen miktarının anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermiştir. Hücresel alımın kantitatif analizi, PNPE ile tedavi edilen floresan ve kemik iliği dendritik hücrelerinin PLGA mikropartikülleri ve yüzey aktif madde stabilize nano emülsiyonu ile tedavi edilenlere göre önemli ölçüde daha yüksek bir göreceli yoğunluğu göstermiştir. Elde edilen sonuçlar, PNPE'nin antijen içselleştirmesini desteklediğini ve antijeni hücre içi olarak etkili bir şekilde verdiğini göstermiştir.
Homojen emülsiyon elde etmek için, karışım sonikasyon sırasında sürekli çalkalanmalıdır.
