قمنا بتطوير الجسيمات النانوية PLGA استقرت مستحلب بيكرينغ. قام مستحلب بيكرينغ بتحسين التقارب الخلوي لخلايا بروتين المستضد ، مما أدى إلى استيعاب المستضدات بكفاءة. كانت مستحلبات بيكرينغ المستقرة بالجسيمات النانوية سهلة التحضير وتوصيل المستضد بكفاءة.
بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام طريقة لمراقبة تقارب المستحلب مع الخلية وتوضيح الاستيعاب. يوفر هذا البروتوكول رؤى لتصميم تركيبات جديدة ذات كفاءة عالية للخلايا واستيعاب فعال للمستضد ، مما يوفر منصة لتطوير لقاحات فعالة. للبدء ، أضف 100 ملليغرام من حمض polylactic-co-glycolic إلى 10 ملليلتر من خليط الأسيتون والإيثانول بنسبة أربعة إلى واحد لتكون بمثابة مرحلة الزيت.
ضع 20 ملليلتر من محلول PVA المائي تحت غطاء الدخان وحركه مغناطيسيا بمعدل 400 دورة في الدقيقة. أضف خمسة ملليلتر من مرحلة الزيت إلى محلول PVA قطرة قطرة باستخدام مضخة حقنة. ثم حرك الخليط في غطاء الدخان حتى تتبخر المذيبات العضوية تماما.
بعد تطاير المذيبات العضوية ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 15،000 G.اغسل ثلاث مرات أو أكثر حتى يصبح ماء الغسيل النهائي واضحا وشفافا. أعد تعليق جسيمات PLGA النانوية المغسولة في ملليلتر من الماء منزوع الأيونات وقم بتجميد الخليط عند 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لتوصيف حجم وإمكانات زيتا لجسيمات PLGA النانوية ، أضف 10 ميكرولتر من جسيمات PLGA النانوية إلى ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول مخفف ونقل المحلول المخفف إلى خلية DTS1070.
قم بتشغيل الكمبيوتر ومحلل تشتت الضوء الديناميكي. ثم ضع خلية DTS1070 في نظام DLS. انقر فوق برنامج Zetasizer وقم بإنشاء ملف قياس جديد لإعداد إجراء التحديد.
ثم ابدأ إجراء التحديد للحصول على حجم الجسيمات وتوزيع زيتا المحتمل. لتحضير جسيمات PLGA النانوية المستقرة مستحلب بيكرينغ ، أو PNPE ، أضف جسيمات PLGA النانوية المجففة بالتجميد إلى الماء منزوع الأيونات بتركيز أربعة ملليغرام لكل ملليلتر ثم أضف السكوالين كطور زيت. إعداد PNPE عن طريق صوتنة خطوة واحدة لمدة خمس دقائق في 100 واط في سونيكاتور حمام مائي.
تمييع 20 ميكرولتر من PNPE ومليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات. إسقاط 20 ميكرولتر من المستحلب على الشريحة. مراقبة مورفولوجيا وتجانس المستحلب باستخدام المجهر الضوئي عند تكبير 40 مرة والحصول على صور فوتوغرافية.
قم بتشغيل طبقة الدوران بالضغط على زر الطاقة. اضغط على زر التحكم واضبط وقت الطلاء وسرعته. قم بتوصيل أنبوب النيتروجين بطبقة الدوران واضبط تجزئة أسطوانة الغاز على 0.4 كيلو باسكال.
ضع الرقاقة النظيفة على كوب الشفط الخاص بطبقة الدوران. أضف 100 ميكرولتر من بولي-ل-ليسين قطرة قطرة إلى مركز مستشعر ثاني أكسيد السيليكون وأغلق الغطاء العلوي لطلاء الدوران. اضغط على زر البدء لبدء طلاء العينة وإيقاف الجهاز عند الانتهاء.
قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ، وأوقف تشغيل أزرار الطاقة والتحكم ، وقم بإزالة مستشعر ثاني أكسيد السيليكون المعدل poly-l-lysine. لتحديد التصاق الحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ب PNPE ، قم بتشغيل الكمبيوتر والوحدة الإلكترونية والمضخة التمعجية ، وقم بتنشيط التحكم في درجة الحرارة في أسفل اليمين في البرنامج للتأكد من أن درجة الحرارة المحددة أقل بحوالي درجة مئوية واحدة تحت درجة حرارة الغرفة. ضع مستشعرات ثاني أكسيد السيليكون المعدلة poly-l-lysine في خلية التدفق وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيل خط القياس بين خلية التدفق ومضخة التدفق.
ضع خلية التدفق داخل نظام وحدة التدفق. انقر فوق شريط أدوات الاستحواذ وحدد إعداد القياس للبحث عن 1 و 3 و 5 و 7 و 9 و 11 أوكتاف من الشريحة في القناة المستخدمة. لتصحيح خط الأساس ، انقر فوق بدء القياس للسماح للهواء بالدخول إلى وحدة التدفق حتى يصبح خط الأساس للهواء سلسا.
بعد تدفق الماء منزوع الأيونات لمدة 10 إلى 15 دقيقة لتمكين توازن خط الأساس للمحلول مرة أخرى ، قم بضخ محلول PNPE المحضر في وحدة التدفق بمعدل تدفق 50 ميكرولتر في الدقيقة لتحقيق امتصاص التوازن على مستشعر ثاني أكسيد السيليكون. قم بضخ محلول الحويصلة خارج الخلية المحضر في وحدة التدفق بمعدل تدفق يبلغ 50 ميكرولتر في الدقيقة لتتبع عملية التصاق bEV بسطح PNPE. احتضان الخلايا المتغصنة لنخاع العظم ب 1640 وسائط كاملة لمدة سبعة أيام ثم بذرها في أطباق ليزر صغيرة متحدة البؤر بمعدل 1 مرة 10 إلى 6 لكل بئر طوال الليل عند 37 درجة مئوية وحاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
امزج 0.5 ملليلتر من السيانين 5 المسمى بالبويضات ، مع 0.5 ملليلتر من PNPE لمدة ساعة واحدة وقم بإزالة المستضد السائل عن طريق الطرد المركزي عند 5،000 جم لمدة 20 دقيقة لتطوير تركيبة اللقاح. بعد إعادة التعليق باستخدام 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، أضف 10 ميكرولتر من التركيبة إلى أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر تحت مقعد نظيف للغاية وشارك في الزراعة مع الخلايا المتغصنة لنخاع العظم لمدة ست ساعات. بعد إزالة سائل الثقافة من الخلايا ، اغسلها مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات مسبقا.
إصلاح الخلايا مع محلول الفورمالديهايد 4 ٪ و PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين أو ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل منهما. تغلغل الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول Triton X-100 بنسبة 0.5٪ لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد غسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS ، قم بتغطية الخلايا الموجودة على الطبق السفلي الزجاجي لأطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر ب 200 ميكرولتر من محلول عمل الفلوريسئين إيزوثيوسيانات المترافق مع القضيب واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ، أعد تثبيت النوى ب 200 ميكرولتر من محلول DAPI لمدة 30 ثانية تقريبا. لتحليل الصور ، قم بتشغيل أجهزة المجهر متحد البؤر بالتسلسل بما في ذلك الليزر والبؤرة والمجهر والكمبيوتر.
انقر فوق البرنامج وحدد Nikon Confocal للدخول إلى نظام الاختبار. في نظام المجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل الوحدات المختلفة بالترتيب المشار إليه. أولا ، قم بإعداد قنوات FITC و DAPI و Cy5 واضبط HV والإزاحة المقابلة.
ثم بعد اختيار عدسة الزيت 100 مرة ووضع قطرة من زيت الأرز في الأعلى ، ضع أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر التي تحتوي على خلايا تغصنية ملطخة بنخاع العظم على مرحلة المجهر. انقر فوق زر المسح الضوئي. تحت المجهر الفلوري ، حدد موقع الخلايا ذات الأهمية عن طريق تحريك المحور السيني والمحور ص والمحور z.
اضبط شدة الليزر وحجم الصورة والمعلمات الأخرى لتمكين مسح الصور متحدة البؤر عالية الجودة. أخيرا ، انقر فوق الزر "التقاط" واحفظ الصور. تم تتبع التصاق الحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ب PNPE باستخدام QCM-D.
انخفاض فوري في التردد ، أشار إلى التصاق سريع للحويصلات خارج الخلية المحاكاة الحيوية إلى PNPE بعد اللقاء. علاوة على ذلك ، انخفض دلتا F مع زيادة تركيز الحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ، مما يعكس تأثيرا يعتمد على التركيز. كانت الجسيمات الدقيقة PLGA ومستحلب النانو المستقر بالسطحي مرتبطة بشكل ضعيف بالحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ، حتى عند التركيز العالي البالغ 80 ميكروغرام لكل ملليلتر ، والذي ربما نتج عن نقص مواقع الاتصال بالخلايا المناعية.
أشارت إشارة الفلورسنت السيانين -5 البيضاوي إلى أن الكمية الإجمالية للمستضد المستنفد المستوعب في الخلايا أعلى بكثير في المجموعة المعالجة ب PNPE مقارنة بتلك الموجودة في الجسيمات الدقيقة PLGA والمجموعة المعالجة بمستحلب النانو المستقر بالسطح. أظهر التحليل الكمي للامتصاص الخلوي كثافة نسبية أعلى بكثير من الخلايا المرابطة الفلورية ونخاع العظم المعالجة ب PNPE مقارنة بتلك المعالجة بالجسيمات الدقيقة PLGA ومستحلب النانو المستقر بالسطح. أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها أن PNPE عزز استيعاب المستضد وقدم المستضد بشكل فعال داخل الخلايا.
من أجل الحصول على مستحلب متجانس ، يجب أن يهتز الخليط باستمرار أثناء الصوتنة.
