Este protocolo es significativo porque describe otra herramienta importante para diseccionar la biología molecular del agente de la enfermedad de Lyme Borrelia burgdorferi. La principal ventaja de esta técnica es que mediante el uso de la transducción de fagos, proporciona un método alternativo para introducir ADN en Borrelia burgdorferi sin requerir la aplicación de un pulso eléctrico, como en la electroporación. Este método podría usarse para proporcionar más información sobre los mecanismos moleculares utilizados por Borrelia burgdorferi para persistir en su ciclo enzoótico y, en última instancia, causar la enfermedad de Lyme en humanos.
Para comenzar, inocule 150 microlitros del clon apropiado de Borrelia burgdorferi en 15 mililitros de BSK en tubos de centrífuga cónica estériles bien tapados para el protocolo de transducción. Luego, complemente el medio con la concentración adecuada de antibióticos o una combinación de antibióticos para la selección y mantenimiento del ADN heterólogo dentro del clon de Borrelia burgdorferi e incube la muestra a 33 grados centígrados. Después de que el cultivo haya crecido, centrifugar el volumen apropiado de cultivo a 6, 000 G durante 10 minutos.
Después de decantar el sobrenadante, resuspender el pellet en cuatro mililitros en BSK fresco y transferir la muestra al tubo estéril más pequeño disponible para contener la muestra con un espacio mínimo en la cabeza. Luego, agregue la cantidad adecuada de agente inductor a la concentración recomendada basada en un volumen de cultivo de cuatro mililitros para inducir la producción de fagos, tape el tubo firmemente y mezcle bien. Incubar la muestra a 33 grados centígrados durante dos a cuatro horas.
Luego, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar la muestra a 6, 000 G durante 10 minutos. Después de decantar el sobrenadante, resuspender el pellet celular en 15 mililitros de BSK.
Complementar el cultivo preparado con la concentración apropiada de antibióticos descrita en el manuscrito, mientras se incuba la muestra a 33 grados centígrados durante 72 a 96 horas. Para preparar soluciones para la precipitación de PEG, prepare 500 mililitros de cloruro de sodio de cinco molares, 500 mililitros de 40% PEG y 100 mililitros de medio de suspensión como se describe en el manuscrito. Para esterilizar, esterilice la solución en autoclave, enfríe antes de usarla y almacene la temperatura ambiente o cuatro grados centígrados.
Para la precipitación PEG del fago del clon donante Borrelia burgdorferi, después de 72 a 96 horas de incubación, centrifugar las muestras a 8, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 mililitros y desechar el pellet celular. Agregue cloruro de sodio de cinco molares a una concentración final de un molar.
Después de mezclar bien, meca suavemente a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar las muestras a 8.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 mililitros como se demostró anteriormente, agregue una solución de 40% PEG-8000 al sobrenadante a una concentración final de 10%Mezcle bien y colóquelo en hielo durante más de una hora, hasta toda la noche.
Centrifugar a las muestras a 8.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados como se demostró anteriormente. Deseche el sobrenadante y elimine la mayor cantidad de líquido en exceso posible sin perder ningún pellet, que contiene las partículas del fago. Vuelva a suspender el pellet en un volumen mínimo de medio de suspensión utilizando el medio de suspensión para lavar el costado de la botella y recoger cualquier partícula de fagos potenciales.
Tratar la muestra de fagos recuperados con un volumen igual de cloroformo basado en el volumen de resuspensión. Mezclar bien la muestra y centrifugar a 8, 000 G durante 10 minutos. Luego, retire la capa acuosa a un tubo limpio, evitando cualquiera de las capas gruesas de la interfaz.
Después de determinar el volumen recuperado, después del primer tratamiento con cloroformo, tratar nuevamente la muestra con una cantidad de cloroformo igual al 10% de ese volumen. Transfiera la capa acuosa a un tubo limpio teniendo cuidado de evitar cualquiera de las capas de interfaz u orgánicas. Use el fago inmediatamente o guárdelo a cuatro grados centígrados.
Después de preparar los cultivos de Borrelia burgdorferi para ser utilizados como receptor en ensayos de transducción como se demostró anteriormente, centrifugar el volumen de cultivo a 6, 000 G durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 14,5 mililitros de BSK fresco. Agregue menos o igual a 500 microlitros de muestra de fagos precipitados con PEG al cultivo del clon receptor.
Después de mezclar bien, incubar a 33 grados centígrados durante 72 a 96 horas. Realizar la selección de transductores por recubrimiento en fase sólida después de mezclarlos con fagos precipitados con PEG como se describe en el manuscrito. Dependiendo de los antecedentes del clon receptor, verifique que las colonias aparezcan dentro de la agarosa en las placas de selección después de 10 a 21 días de incubación.
Elija al menos de 5 a 10 colonias que crezcan en la placa en presencia de ambos antibióticos usando pipeta de borosilicato esterilizada de algodón de 5.75 pulgadas e indíquelas en 1.5 mililitros de BSK con el antibiótico apropiado. La amplificación por PCR de los genes se realizó en 10 de los clones que codifican resistencia a kanamicina y gentamicina. El gen de resistencia a la kanamicina podría amplificarse a partir del donante c1673 y los transductores potenciales, pero no del receptor c1706.
Del mismo modo, el gen de resistencia a la gentamicina podría amplificarse a partir del receptor c1706 y los transductores potenciales, pero no del donante, lo que representa eventos de transducción. Demostrar que el casete de resistencia a la kanamicina fue transducido por 5BB1 del donante al receptor. El fondo de los transductores se determinó utilizando marcadores específicos de la cepa.
El clon c1673 y el fondo CA-112A codifican amplicones específicos cuatro, cinco y seis, mientras que c1706, que tiene un fondo B31 de paso alto, no lo hace. Del mismo modo, a los transductores uno y dos les faltaban los amplicones cuatro, cinco y seis, lo que demuestra que los clones tienen el fondo c1706 y han adquirido el gen de resistencia a la kanamicina de c1673. Para la precipitación de fagos por PEG, realice todos los pasos cuidadosamente para maximizar el rendimiento del fago y trate el fago resuspendido a fondo con cloroformo para eliminar la mayor cantidad posible de PEG y contaminantes de medios de cultivo antes del uso y almacenamiento de fagos.
Una vez que el ensayo de transducción se ha realizado con éxito y el transductor verificado, estos clones están disponibles para responder a las preguntas que requieren Borrelia burgdorferi genéticamente modificada. Se espera que el desarrollo de esta técnica permita a los investigadores manipular genéticamente las cepas de Borrelia burgdorferi para las cuales la introducción de ADN a través de la electroporación es actualmente difícil.
