Este método puede ayudar a las investigaciones a encontrar rápidamente y sin esfuerzo períodos anormales de desarrollo del embrión de tomate. La principal ventaja de este protocolo es un tratamiento de semillas de tomate con hipoclorito de sodio que proporciona una base para la observación de embriones de tomate. Comience con la preparación química y la cosecha de los frutos de Solanum lycopersicum de tres a 23 días después de la floración o DAF.
Inmediatamente ponga las frutas en hielo y divídalas en frutas tempranas, medias y tardías, según los días posteriores a la floración. Rompa la fruta temprana, colóquela en un portaobjetos y recoja cuidadosamente las semillas frescas con pinzas de precisión con un aumento de 1x a 4x del microscopio estéreo. Para frutas medias y tardías, rompa la fruta y recoja directamente las semillas frescas con pinzas de precisión.
En el método convencional, transfiera las semillas recién recolectadas inmediatamente a un tubo centrífugo de dos mililitros que contenga 1,5 mililitros de fijador FAA y coloque el tubo en el agitador orbital a 5 rpm durante cuatro horas a temperatura ambiente. Luego deshidratar las semillas en 70% 95% y 100% etanol durante una hora cada una en un agitador orbital a 5 rpm. Una vez hecho esto, coloque la semilla en las tres a cinco gotas de solución de limpieza presente en el portaobjetos y cúbrala suavemente con un cubreobjetos.
Use un solo portaobjetos cóncavo para semillas medias y tardías. Dependiendo de las etapas de desarrollo de las semillas, incubarlas a temperatura ambiente para su limpieza. Después de la incubación, observe las muestras con un contraste de interferencia diferencial, o microscopio DIC equipado con una cámara digital con aumentos de 10x, 20x y 40x.
Ajuste y optimice el brillo de la luz transmitida, el control deslizante DIC y la apertura del condensador en tiempo real para cada muestra y capture imágenes. Transfiera las semillas frescas recolectadas de las frutas rotas a un tubo de centrífuga de dos mililitros que contenga 1,5 mililitros de solución desinfectante. Incubar las muestras en un agitador orbital a 30 rpm durante tres a 50 minutos a temperatura ambiente.
Una vez que el contorno de la capa de semilla más interna sea claramente visible, deseche la solución desinfectante. Para semillas medias y tardías, transfiera las semillas a un portaobjetos. Use fórceps y una aguja de disección para extraer el mucílago de semilla con un aumento de 1x a 4x del microscopio estéreo.
Transfiera las semillas de nuevo al tubo de centrífuga original usando pinzas. Lávelos cinco veces en 1,5 mililitros de agua desionizada durante 10 segundos cada uno, y deseche el agua desionizada. A continuación, agregue el doble volumen de la solución de limpieza a las semillas.
Dependiendo de la etapa de semilla, administre el tratamiento de vacío intermitente de cero a 50 minutos, con intervalos de 10 minutos después de cada tratamiento al vacío de 10 minutos. Después del tratamiento con vacío, reemplace la solución de aclaración. Para facilitar el aclarado de las semillas, coloque el tubo de centrífuga protegido de la luz durante 30 minutos a siete días a temperatura ambiente.
En el caso de embriones tardíos, reemplace la solución diariamente con una solución de aclaramiento fresca, seguido de someter las semillas a un tratamiento de vacío durante 10 minutos. Coloque las semillas limpias en el portaobjetos o en un solo portaobjetos cóncavo. Utilizando el microscopio DIC equipado con una cámara digital, ajuste y optimice el brillo de la luz transmitida, el control deslizante DIC y la apertura del condensador en tiempo real para cada muestra y capture la imagen.
En el método convencional de limpieza de semillas de S.lycopersicum, las células densas del endospermo bloquearon la visualización de embriones tempranos a 3 y 6 DAF. La disminución de la permeabilidad durante el crecimiento de la semilla dio lugar a imágenes borrosas después de 9 DAF. El mucílago de la semilla y la cubierta de la semilla se volvieron gradualmente más densos, evitando la penetración de agentes de limpieza desde 13 DAF en adelante.
El contorno del embrión dentro de 14 a 19 semillas DAF estaba extremadamente borroso, a pesar del tiempo de tratamiento extendido de siete días. La estructura interna de 22 semillas DAF era completamente invisible. El mucílago de la cubierta de semilla despojado producido por las células epidérmicas de la cubierta de la semilla fue prominente desde 13 DAF en adelante.
El tratamiento con hipoclorito de sodio permitió una identificación clara de la capa interna de la semilla y el desprendimiento de la mayor parte del mucílago adherente sin dañar la semilla. En el protocolo de limpieza optimizado, las semillas mostraron una transparencia satisfactoria en todas las etapas de desarrollo probadas. Se observaron las distintas capas celulares de la cubierta de semilla a 3 DAF, células de endospermo distinguibles a 5 DAF, el embrión en forma de palo a siete DAF, la etapa globular a 9 DAF y la etapa cardíaca a 11 DAF.
En el protocolo optimizado, el grado del rizo de los cotiledones y el meristemo apical del brote se capturó muy fácilmente en varias etapas del desarrollo embrionario. La esterilización elimina el mucílago de la semilla y el pigmento de la cubierta de la semilla, lo que mejora la penetración y la visualización de la semilla. El tratamiento con vacío puede acelerar la penetración de la solución de limpieza.
