この方法は、研究がトマト胚発生の異常な期間を迅速かつ楽に見つけるのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、トマト胚の観察の基礎を提供する次亜塩素酸ナトリウムによるトマト種子の処理です。開花またはDAFの3〜23日後にSolanum lycopersicum果実の化学的調製および収穫から始めます。
すぐに果物を氷の上に置き、開花後の日数に基づいて、それらを早い、中期、遅い果物に分けます。初期の果物を割ってスライドに置き、実体顕微鏡の1倍から4倍の倍率で精密鉗子で新鮮な種子を注意深く集めます。中期および後期の果物の場合は、果物を壊し、精密鉗子を使用して新鮮な種子を直接収集します。
従来の方法では、採取したばかりの種子を直ちに1.5ミリリットルのFAA固定液を入れた2ミリリットルの遠沈管に移し、チューブをオービタルシェーカーに5rpmで室温で4時間置きます。次に、種子を70%95%および100%エタノールで、オービタルシェーカーで5rpmでそれぞれ1時間脱水します。完了したら、スライド上にある3〜5滴の透明溶液に種子を入れ、カバースリップでそっと覆います。
中期および後期の種子には単一の凹型スライドを使用します。種子の発育段階に応じて、透明化のために室温でそれらをインキュベートします。インキュベーション後、微分干渉コントラスト、またはデジタルカメラを搭載したDIC顕微鏡で10倍、20倍、40倍の倍率でサンプルを観察します。
透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをサンプルごとにリアルタイムで調整および最適化し、画像をキャプチャします。壊れた果物から集めた新鮮な種子を、1.5ミリリットルの消毒液を入れた2ミリリットルの遠沈管に移します。サンプルをオービタルシェーカーで30rpmで室温で3〜50分間インキュベートします。
最も内側の種皮の輪郭がはっきりと見えたら、消毒液を廃棄します。中期および後期の種子の場合は、種子をスライドに移します。鉗子と解剖針を使用して、実体顕微鏡の1倍から4倍の倍率で種子粘液を除去します。
鉗子を使用して種子を元の遠心チューブに戻します。1.5ミリリットルの脱イオン水でそれぞれ10秒間5回洗浄し、脱イオン水を廃棄します。次に、2倍量の透明化溶液を種子に加えます。
シード段階に応じて、0〜50分間の間欠的な真空処理を行い、各真空処理の後に10分間隔で10分間の真空処理を行います。真空処理後、透明化液を交換してください。種子の除去を容易にするために、室温で30分から7日間光から保護された遠沈管を置きます。
後期胚の場合は、毎日溶液を新鮮な透明化溶液と交換し、続いて種子を10分間真空処理します。クリアしたシードをスライドまたは単一の凹面スライドに置きます。デジタルカメラを搭載したDIC顕微鏡を用いて、サンプルごとに透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをリアルタイムで調整・最適化し、画像を撮影します。
従来のS.lycopersicum種子の除去方法では、高密度の胚乳細胞が3および6DAFで初期胚の可視化をブロックしました。種子成長中の透過性の低下は、9DAF後にぼやけた画像をもたらしました。種子粘液と種皮は徐々に密度が高くなり、13DAF以降は透明化剤の浸透が妨げられました。
14〜19個のDAF種子内の胚の輪郭は、7日間の延長された処理時間にもかかわらず、非常にぼやけていました。22個のDAFシードの内部構造は完全に見えませんでした。種皮表皮細胞が産生する剥ぎ取られた種皮粘液は、13DAF以降に顕著であった。
次亜塩素酸ナトリウム処理により,種子損傷なしに内種皮の明確な同定と付着性粘液のほとんどの剥離が可能となった。最適化された清算プロトコルでは、種子はテストされたすべての発達段階で満足のいく透明性を示しました。3DAFでは種皮の明瞭な細胞層、5DAFでは識別可能な胚乳細胞、7DAFでは棒状胚、9DAFでは球状、11DAFでは心臓期が観察された。
最適化されたプロトコルでは、子葉とシュート頂端分裂組織のカールの程度は、胚発生のさまざまな段階で非常に簡単に捕捉されました。滅菌により、種子粘液と種皮色素が除去され、種子の浸透と視覚化が向上します。真空処理は、透明化溶液の浸透を加速することができます。
