Bu yöntem, araştırmaların domates embriyosu gelişiminin anormal dönemlerini hızlı ve zahmetsizce bulmalarına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, domates tohumlarının domates embriyolarının gözlemlenmesi için bir temel sağlayan sodyum hipoklorit ile muamele edilmesidir. Çiçeklenme veya DAF'tan üç ila 23 gün sonra Solanum lycopersicum meyvelerinin kimyasal olarak hazırlanması ve toplanmasıyla başlayın.
Meyveleri hemen buz üzerine koyun ve çiçeklenmeden sonraki günlere göre erken, orta ve geç meyvelere bölün. Erken meyveyi kırın, bir slayta koyun ve stereo mikroskobun 1x ila 4x büyütmesi altında hassas forseps ile taze tohumları dikkatlice toplayın. Orta ve geç meyveler için, meyveyi kırın ve hassas forseps kullanarak doğrudan taze tohumlar toplayın.
Geleneksel yöntemde, taze toplanan tohumları derhal 1,5 mililitre FAA fiksatif içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında dört saat boyunca 5 rpm'de orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra tohumları% 70% 95 ve% 100 etanol içinde, 5 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda her biri bir saat boyunca dehidre edin. Tamamlandığında, tohumu slaytta bulunan üç ila beş damla temizleme çözeltisine yerleştirin ve yavaşça bir kapak kayması ile örtün.
Orta ve geç tohumlar için tek bir içbükey slayt kullanın. Tohumların gelişim aşamalarına bağlı olarak, temizleme için oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, numuneleri diferansiyel girişim kontrastı veya 10x, 20x ve 40x büyütmede bir dijital kamera ile donatılmış DIC mikroskobu ile gözlemleyin.
İletilen ışık parlaklığını, DIC kaydırıcısını ve kondenser diyaframını her örnek için gerçek zamanlı olarak ayarlayın ve optimize edin ve görüntüleri yakalayın. Kırık meyvelerden toplanan taze tohumları, 1,5 mililitre dezenfektan çözeltisi içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneleri 30 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında üç ila 50 dakika boyunca inkübe edin.
En içteki tohum kabuğu taslağı açıkça görülebildiğinde, dezenfektan çözeltisini atın. Orta ve geç tohumlar için, tohumları bir slayta aktarın. Stereo mikroskobun 1x ila 4x büyütmesi altındaki tohum müsilajını çıkarmak için forseps ve diseksiyon iğnesi kullanın.
Forseps kullanarak tohumları orijinal santrifüj tüpüne geri aktarın. Her biri 10 saniye boyunca 1,5 mililitre deiyonize suda beş kez yıkayın ve deiyonize suyu atın. Ardından, temizleme çözeltisinin çift hacmini tohumlara ekleyin.
Tohum aşamasına bağlı olarak, aralıklı vakum işlemini sıfır ila 50 dakika boyunca, 10 dakikalık her vakum işleminden sonra 10 dakikalık aralıklarla verin. Vakumlu işlemden sonra, temizleme çözeltisini değiştirin. Tohumların temizlenmesini kolaylaştırmak için, ışıktan korunan santrifüj tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika ila yedi gün boyunca yerleştirin.
Geç embriyolar durumunda, çözeltiyi günlük olarak taze bir temizleme çözeltisi ile değiştirin, ardından tohumları 10 dakika boyunca vakum işlemine tabi tutun. Temizlenmiş tohumları slayta veya tek içbükey slayta yerleştirin. Dijital kamera ile donatılmış DIC mikroskobu kullanarak, iletilen ışık parlaklığını, DIC kaydırıcısını ve kondenser diyaframını her örnek için gerçek zamanlı olarak ayarlayın ve optimize edin ve görüntüyü yakalayın.
Geleneksel S.lycopersicum tohumlarını temizleme yönteminde, yoğun endosperm hücreleri erken embriyoların 3 ve 6 DAF'ta görselleştirilmesini engelledi. Tohum büyümesi sırasında azalan geçirgenlik, 9 DAF'tan sonra bulanık görüntülere neden oldu. Tohum müsilaj ve tohum kabuğu giderek daha yoğun hale geldi ve 13 DAF'tan itibaren temizleme maddelerinin nüfuz etmesini engelledi.
14 ila 19 DAF tohumunun içindeki embriyonun ana hatları, yedi günlük uzun tedavi süresine rağmen son derece bulanıktı. 22 DAF tohumundaki iç yapı tamamen görünmezdi. Tohum kabuğu epidermal hücreleri tarafından üretilen soyulmuş tohum kabuğu müsilajı, 13 DAF'tan itibaren belirgindi.
Sodyum hipoklorit muamelesi, iç tohum kabuğunun net bir şekilde tanımlanmasını ve yapışkan müsilajın çoğunun tohum hasarı olmadan ayrılmasını sağladı. Optimize edilmiş temizleme protokolünde, tohumlar test edilen tüm gelişim aşamalarında tatmin edici şeffaflık göstermiştir. 3 DAF'ta tohum kabuğunun farklı hücre katmanları, 5 DAF'ta ayırt edilebilir endosperm hücreleri, yedi DAF'ta çubuk şeklindeki embriyo, 9 DAF'ta küresel aşama ve 11 DAF'ta kalp aşaması gözlendi.
Optimize edilmiş protokolde, kotiledonların kıvrılma derecesi ve sürgün apikal meristemi, embriyonik gelişimin çeşitli aşamalarında çok kolay bir şekilde yakalandı. Sterilizasyon, tohum penetrasyonunu ve görselleştirmeyi artıran tohum müsilajını ve tohum kabuğu pigmentini giderir. Vakum işlemi, temizleme çözeltisinin penetrasyonunu hızlandırabilir.
