이 방법은 연구가 토마토 배아 발달의 비정상적인 기간을 빠르고 쉽게 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 큰 장점은 토마토 배아의 관찰을위한 기초를 제공하는 차아 염소산 나트륨으로 토마토 씨앗을 처리하는 것입니다. 개화 또는 DAF 후 3-23 일 후에 Solanum lycopersicum 과일의 화학 준비 및 수확으로 시작하십시오.
즉시 과일을 얼음에 놓고 개화 후 날을 기준으로 초기, 중간 및 후기 과일로 나눕니다. 초기 과일을 깨뜨려 슬라이드에 올려 놓고 실체 현미경의 1x-4x 배율로 정밀 집게로 신선한 씨앗을 조심스럽게 모으십시오. 중간 및 후기 과일의 경우 과일을 깨고 정밀 집게를 사용하여 신선한 씨앗을 직접 수집합니다.
기존의 방법에서는 새로 수집 한 종자를 1.5 밀리리터 FAA 정착액이 들어있는 2 밀리리터 원심 분리 튜브에 즉시 옮기고 튜브를 실온에서 4 시간 동안 5rpm으로 궤도 셰이커에 놓습니다. 그런 다음 종자를 70 % 95 % 및 100 % 에탄올에서 5rpm의 궤도 셰이커에서 각각 1 시간 동안 탈수시킵니다. 완료되면 슬라이드에 있는 3-5방울의 투명화 용액에 씨앗을 넣고 커버 슬립으로 부드럽게 덮습니다.
중간 및 후기 씨앗에 단일 오목한 슬라이드를 사용하십시오. 씨앗의 발달 단계에 따라 실온에서 배양하여 청소하십시오. 배양 후 미분 간섭 대비 또는 디지털 카메라가 장착된 DIC 현미경으로 샘플을 10x, 20x 및 40x 배율로 관찰합니다.
투과광 밝기, DIC 슬라이더 및 콘덴서 조리개를 각 샘플 및 캡처 이미지에 대해 실시간으로 조정하고 최적화합니다. 깨진 과일에서 채취 한 신선한 씨앗을 1.5 밀리리터의 소독액이 들어있는 2 밀리리터 원심 분리기 튜브에 옮깁니다. 샘플을 실온에서 3 내지 50분 동안 30rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다.
가장 안쪽의 종자 코트 윤곽이 명확하게 보이면 소독액을 폐기하십시오. 중간 및 후기 씨앗의 경우 씨앗을 슬라이드로 옮깁니다. 집게와 해부 바늘을 사용하여 실체 현미경의 1x에서 4x 배율로 종자 점액을 제거합니다.
집게를 사용하여 씨앗을 원래의 원심 분리기 튜브로 다시 옮깁니다. 이들을 1.5 밀리리터의 탈이온수에서 각각 10초 동안 5회 세척하고, 탈이온수를 버린다. 다음으로, 두 배의 양의 클리어링 용액을 씨앗에 첨가하십시오.
시드 단계에 따라 0분에서 50분 동안 간헐적 진공 처리를 하고 각 진공 처리 후 10분 간격으로 10분 간격으로 합니다. 진공 처리 후 클리어링 용액을 교체하십시오. 씨앗 제거를 용이하게하려면 빛으로부터 보호 된 원심 분리기 튜브를 실온에서 30 분에서 7 일 동안 두십시오.
후기 배아의 경우, 매일 용액을 신선한 청산 용액으로 교체 한 다음 종자를 10 분 동안 진공 처리하십시오. 깨끗한 씨앗을 슬라이드 또는 단일 오목한 슬라이드에 놓습니다. 디지털 카메라가 장착 된 DIC 현미경을 사용하여 각 샘플에 대해 투과광 밝기, DIC 슬라이더 및 콘덴서 조리개를 실시간으로 조정 및 최적화하고 이미지를 캡처합니다.
S.lycopersicum 종자를 제거하는 기존의 방법에서, 조밀 한 배유 세포는 3 및 6 DAF에서 초기 배아의 시각화를 차단했습니다. 종자 성장 동안 감소된 투과성은 9 DAF 후에 퍼지 이미지를 초래했습니다. 종자 점액과 종자 코트가 점차 조밀 해져 13 DAF부터 제거제가 침투하는 것을 방지했습니다.
14-19 개의 DAF 종자 내부의 배아의 윤곽은 7 일의 연장 된 치료 시간에도 불구하고 매우 흐려졌습니다. 22 개의 DAF 종자의 내부 구조는 완전히 보이지 않았습니다. 종자 코트 표피 세포에 의해 생성 된 박리 된 종자 코트 점액은 13 DAF 이후부터 두드러졌다.
나트륨 차아염소산염 처리는 내부 종자 코트의 명확한 식별과 종자 손상 없이 부착성 점액의 대부분을 분리할 수 있게 했습니다. 최적화된 청산 프로토콜에서 종자는 테스트된 모든 발달 단계에서 만족스러운 투명성을 보여주었습니다. 3 DAF에서 종자 코트의 뚜렷한 세포층, 5 DAF에서 구별 가능한 배유 세포, 7 DAF에서 막대기 모양의 배아, 9 DAF에서 구형 단계 및 11 DAF에서 심장 단계가 관찰되었습니다.
최적화 된 프로토콜에서, 자엽과 싹 꼭대기 분열 조직의 컬 정도는 배아 발달의 다양한 단계에서 매우 쉽게 포착되었습니다. 살균은 종자 점액과 종자 코트 색소를 제거하여 종자 침투와 시각화를 향상시킵니다. 진공 처리는 클리어링 용액 침투를 가속화 할 수 있습니다.
