Questo metodo può aiutare le ricerche a trovare rapidamente e senza sforzo periodi anormali di sviluppo dell'embrione di pomodoro. Il principale vantaggio di questo protocollo è un trattamento dei semi di pomodoro con ipoclorito di sodio che fornisce una base per l'osservazione degli embrioni di pomodoro. Inizia con la preparazione chimica e la raccolta dei frutti di Solanum lycopersicum da tre a 23 giorni dopo la fioritura o DAF.
Metti immediatamente i frutti sul ghiaccio e dividili in frutti precoci, medi e tardivi, in base ai giorni successivi alla fioritura. Rompere il frutto precoce, metterlo su un vetrino e raccogliere i semi freschi con cura con una pinza di precisione con ingrandimento da 1x a 4x del microscopio stereo. Per i frutti medi e tardivi, rompere il frutto e raccogliere direttamente i semi freschi usando una pinza di precisione.
Nel metodo convenzionale, trasferire immediatamente i semi appena raccolti in un tubo di centrifuga da due millilitri contenente fissativo FAA da 1,5 millilitri e posizionare il tubo sullo shaker orbitale a 5 giri / min per quattro ore a temperatura ambiente. Quindi disidratare i semi in etanolo al 70% 95% e 100% per un'ora ciascuno su uno shaker orbitale a 5 giri / min. Una volta fatto, posizionare il seme nelle tre-cinque gocce di soluzione trasparente presente sul vetrino e coprirlo delicatamente con un vetrino di copertura.
Utilizzare una singola diapositiva concava per semi medi e tardivi. A seconda delle fasi di sviluppo dei semi, incubarli a temperatura ambiente per la pulizia. Dopo l'incubazione, osservare i campioni con un contrasto di interferenza differenziale, o microscopio DIC dotato di una fotocamera digitale con ingrandimento 10x, 20x e 40x.
Regola e ottimizza la luminosità della luce trasmessa, il cursore DIC e l'apertura del condensatore in tempo reale per ogni campione e acquisisci immagini. Trasferire i semi freschi raccolti dai frutti rotti in un tubo da centrifuga da due millilitri contenente 1,5 millilitri di soluzione disinfettante. Incubare i campioni su uno shaker orbitale a 30 giri / min per tre a 50 minuti a temperatura ambiente.
Una volta che il contorno del rivestimento più interno del seme è chiaramente visibile, scartare la soluzione disinfettante. Per i semi medi e tardivi, trasferire i semi su un vetrino. Utilizzare una pinza e un ago da dissezione per rimuovere la mucillagine del seme con un ingrandimento da 1x a 4x del microscopio stereo.
Trasferire nuovamente i semi nel tubo della centrifuga originale usando una pinza. Lavarli cinque volte in 1,5 millilitri di acqua deionizzata per 10 secondi ciascuno e scartare l'acqua deionizzata. Quindi, aggiungere il doppio volume della soluzione di compensazione ai semi.
A seconda della fase di semina, somministrare il trattamento sottovuoto intermittente da zero a 50 minuti, con intervalli di 10 minuti dopo ogni trattamento sottovuoto di 10 minuti. Dopo il trattamento sottovuoto, sostituire la soluzione di pulizia. Per facilitare la rimozione dei semi, posizionare il tubo della centrifuga protetto dalla luce per 30 minuti a sette giorni a temperatura ambiente.
Nel caso di embrioni tardivi, sostituire la soluzione ogni giorno con una soluzione di pulizia fresca, seguita da sottoporre i semi a trattamento sottovuoto per 10 minuti. Posizionare i semi eliminati sul vetrino o sul singolo vetrino concavo. Utilizzando il microscopio DIC dotato di una fotocamera digitale, regolare e ottimizzare la luminosità della luce trasmessa, il cursore DIC e l'apertura del condensatore in tempo reale per ogni campione e catturare l'immagine.
Nel metodo convenzionale di eliminazione dei semi di S.lycopersicum, le dense cellule endospermatiche hanno bloccato la visualizzazione dei primi embrioni a 3 e 6 DAF. La diminuzione della permeabilità durante la crescita del seme ha portato a immagini sfocate dopo 9 DAF. La mucillagine e il rivestimento del seme sono diventati gradualmente più densi, impedendo la penetrazione degli agenti chiarificatori dal 13 DAF in poi.
Il contorno dell'embrione all'interno di 14-19 semi DAF era estremamente sfocato, nonostante il lungo tempo di trattamento di sette giorni. La struttura interna di 22 sementi DAF era completamente invisibile. La mucillagine del rivestimento del seme spogliato prodotta dalle cellule epidermiche del rivestimento del seme era prominente dal 13 DAF in poi.
Il trattamento con ipoclorito di sodio ha permesso una chiara identificazione del rivestimento interno del seme e il distacco della maggior parte della mucillagine aderente senza danni ai semi. Nel protocollo di compensazione ottimizzato i semi hanno mostrato una trasparenza soddisfacente in tutte le fasi di sviluppo testate. Sono stati osservati gli strati cellulari distinti del rivestimento del seme a 3 DAF, le cellule endospermatiche distinguibili a 5 DAF, l'embrione a forma di bastoncino a sette DAF, lo stadio globulare a 9 DAF e lo stadio cardiaco a 11 DAF.
Nel protocollo ottimizzato, il grado del ricciolo di cotiledoni e meristema apicale di tiro è stato catturato molto facilmente in varie fasi dello sviluppo embrionale. La sterilizzazione rimuove la mucillagine dei semi e il pigmento del rivestimento del seme, che migliorano la penetrazione e la visualizzazione dei semi. Il trattamento sotto vuoto può accelerare la penetrazione della soluzione di pulizia.
