El propósito general de este método es analizar el efecto del tratamiento del estrés en las células bacterianas, tanto en la célula única como en el nivel de la población. Proporciona una visión global del efecto del estrés en varios aspectos del crecimiento bacteriano, incluyendo la viabilidad celular, morfología, y el contenido de ADN. También permite caracterizar la recuperación de la población.
Este método podría ser utilizado en la industria farmacéutica para detectar la actividad de la nueva molécula antimicrobiana y apreciar su impacto en la viabilidad y el crecimiento de las bacterias. El tratamiento que induce el estrés tiene una ineficiencia, como la dosis y depende del tiempo. Puede ser necesario realizar pruebas preliminares para determinar la dosis óptima y la duración del tratamiento antes de iniciar este protocolo.
La demostración visual de este método permite imaginar detalles importantes de cada paso crítico y cómo realizarlos correctamente. Para empezar, inocular cinco mililitros de MOPS EZ Rich Defined Medium con una sola colonia de E. coli MG1655 HU-PAmCherry y crecer a 37 grados celsius con temblores a 140 rotaciones por minuto durante la noche. A la mañana siguiente, extraiga 100 microlitros de la muestra y diluya con 900 microlitros de medio para medir la densidad óptica a 600 nanómetros.
A continuación, diluir el cultivo en un tubo de ensayo que contenga un medio fresco a un nanómetro OD600 de 0,01. Incubar el tubo de ensayo inoculado a 37 grados Celsius con agitación a 140 RPM hasta que la densidad óptica alcance 0.2, correspondiente a la fase exponencial completa en medio rico. A continuación, aliquot las muestras de cultivo para la toma de imágenes de microscopía de lapso de tiempo, el ensayo de dilución y chapado, el análisis de citometría de flujo y la imagen de instantánea de microscopía.
Exponga los 4,4 mililitros restantes de cultivo celular en el tubo de ensayo a un tratamiento específico contra el estrés. Por ejemplo, 4,4 microlitros de cefalexina a cinco microgramos por mililitro e incubar a 37 grados centígrados con temblores a 140 RPM. Preparar diluciones seriales de diez veces, hasta 10 a menos séptima, de las 200 microlitros de la muestra de cultivo en medio fresco.
Mezclar entre cada dilución por vórtices muy suaves o invirtiendo el tubo. Placa 100 microlitros de la dilución apropiada en placas de agarosa LB no seleccionadas e incubar durante la noche a 37 grados celsius. Al día siguiente, cuente el número de colonias para determinar la concentración de células viables en cada muestra de cultivo.
Trazar la CFU por mililitro en función del tiempo para los cultivos celulares no tratados y tratados. Mida el OD600 de la cultura en un espectrofotómetro. Diluir la muestra de cultivo con un medio fresco a cuatro grados centígrados para obtener una muestra con OD600 a 0,06, correspondiente a aproximadamente 15.000 células por microlitro.
Para la tinción de ADN, mezcle la muestra bacteriana diluida con una solución de 10 microgramos por mililitro de colorante fluorescente de ADN a la ración de volumen de uno a uno e incubar en la oscuridad durante 15 minutos. Antes de la inyección de la muestra, mezcle la muestra por vórtices muy suaves o invirtiendo el tubo. Pase la muestra al citometro de flujo a un caudal de aproximadamente 120.000 células por minuto.
Adquiera luz dispersa hacia adelante y dispersa lateralmente, así como una señal fluorescente/fluorescente de ADN con los ajustes adecuados. Trazar el histograma de densidad celular disperso hacia delante para representar la distribución del tamaño de la célula y trazar el histograma de densidad de celda de señal fluorescente/colorante fluorescente de ADN para representar el contenido de ADN en la población celular. Primero, precalienta la cámara del microscopio termostatado a 37 grados Celsius para estabilizar la temperatura.
Prepare las diapositivas montadas en agarosa como se describe en el manuscrito. Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y realice la adquisición de imágenes utilizando la luz transmitida con un objetivo de contraste facial y con excitación de fuente de luz a 560 nanómetros para mCherry. Seleccione campos de visión que contengan celdas aisladas para facilitar la detección automatizada de celdas durante el análisis de imágenes.
Asegúrese de que al menos 300 celdas se utilizan para permitir un análisis estadístico sólido de la población celular. En primer lugar, retire la solución de conservación de la placa microfluídica y sustitúyalo por un medio fresco precalentado a 37 grados Centígrados como se describe en la Guía del usuario de Microfluidic Software. Fije la placa microfluídica al sistema del colector.
Y en el software microfluídico, haga clic en el botón Sellar para sellar en la placa al sistema múltiple. Después de eso, haga clic en el botón Priming. Coloque la placa microfluídica con el sistema del colector en la etapa del microscopio y precaliente a 37 grados centígrados durante dos horas para evitar la dilatación de la cámara microfluídica.
Cierre la placa microfluídica del sistema microfluídico haciendo clic en el botón Seal Off. Sustituya el medio de pozo ocho por 150 microlitros de muestra de cultivo y sustituya el medio del pozo uno al cinco por el medio deseado, con o sin el reactivo que induce la tensión. Selle la placa microfluídica y colóquela en la etapa del microscopio.
En el software microfluídico, ejecute el procedimiento de carga de celdas. Compruebe que la carga de las células es satisfactoria mirando bajo el microscopio en luz transmitida. Concéntrese cuidadosamente en el modo de luz transmitida y seleccione varios campos de visión que muestren bacterias aisladas y no estén superpoblados, alrededor de 10 a 20 células por cada 100 microlitros cuadrados.
En el software microfluídico, haga clic en el botón Ejecutar una secuencia personalizada y, a continuación, programe la inyección del medio inductor de estrés durante 10 minutos a dos PSI, seguido de la inyección en una PSI durante la duración deseada del tratamiento de estrés. Realice imágenes de microscopía en el modo de lapso de tiempo con un fotograma cada 10 minutos, utilizando contraste de fase en la luz transmitida y una fuente de luz de excitación de 560 nanómetros para la señal mCherry si es necesario. Inicie la adquisición de imágenes microscópicas y el protocolo de inyección microfluídica al mismo tiempo.
Abra el software Fiji y el plugin MicrobeJ. Para el análisis de instantáneas, suelte todas las imágenes correspondientes a una diapositiva de microscopio en la barra de carga de MicrobeJ para concatenar imágenes y guardar el archivo de pilas de imágenes obtenidas. Para los datos de lapso de tiempo, simplemente suelte la pila de imágenes en la barra de carga de MicrobeJ.
Ejecutar la detección automatizada de los contornos de la célula en función de la segmentación de la imagen de contraste de fase y ejecutar la detección de los nucleoides en función de la segmentación de la señal fluorescente de ADN teñido. Compruebe visualmente la precisión de la detección de celdas y utilice la herramienta de edición MicrobeJ para corregirla si es necesario. Guarde el archivo de resultados obtenido.
Haga clic en el icono ResultJ para completar el análisis y obtener la ventana ResultJ. Se generan muchos tipos diferentes de gráficos de salida. Trazar los histogramas normalizados de la forma o longitud de la célula y el número medio de nucleoides por celda.
Este estudio analizó el comportamiento de las células de Escherichia coli K-12 durante la exposición transitoria a la cefalexina, un antibiótico que inhibe específicamente la división celular. Los cultivos celulares que crecen en presencia de cefalexina exhibieron aumentos similares de OD600 a medida que los cultivos sin estmente. La concentración de células viables no aumentó cuando había cefalexina.
Las células comenzaron a dividirse de nuevo cuando se eliminó la cefalexina y finalmente alcanzaron una concentración equivalente al cultivo sin estrés después de dos horas. Diferentes tensiones resultaron en un desacoplamiento de la OD y la CFU por mililitro curvas, dependiendo del efecto inducido. La exposición a cefalexina provocó un aumento paralelo del tamaño de la célula y el contenido de ADN.
Cuando se eliminó la cefalexina, el tamaño de las células de la población y el contenido de ADN disminuyeron gradualmente y se volvieron similares a la población sin estes después de dos horas. La cefalexina provocó la formación de células largas con un ancho celular normal y luego sin septa de división. El análisis cuantitativo de imágenes confirmó el tamaño de la célula y el aumento del contenido de ADN.
Las imágenes de lapso de tiempo confirman que el alargamiento celular y la replicación y segregación de cromosomas no se inhibieron por la exposición a la cefalexina. El análisis del linaje celular filamentado mostró que la división celular se reinició aproximadamente 20 minutos después de lavar el medicamento. Es crucial asegurarse de que la población bacteriana está en pleno crecimiento exponencial antes de inducir tratamientos de estrés.
El tratamiento que induce el estrés utilizado para estos enfoques podría ser peligroso para la experimentalidad, como el compuesto genotóxico. Así que manipule el compuesto con cuidado y use guantes, máscaras, gafas y bata de laboratorio.
